Expédient Synthèse de SMAMPs via Click Chemistry

Infections causées par des bactéries

sont une menace croissante pour la sécurité humaine et le bien-être. Chaque année

un grand nombre de décès sont causés par des infections bactériennes.1 Les antibiotiques traditionnels utilisés pour traiter ces bactéries

les infections, telles que les # β -lactams, deviennent inefficaces

les bactéries développent une résistance à leur égard. Alors que les bactéries se développent

la résistance à un rythme alarmant, le développement de nouveaux antibiotiques

a ralenti considérablement, de nombreuses sociétés pharmaceutiques abandonnant

leur recherche d’antibiotiques, ce qui entraîne de moins en moins d’antibiotiques

approuvé par la FDA (Food and Drug Administration) .2 Les peptides antimicrobiens (AMP) représentent une classe d’antibiotiques

actuellement en cours d’étude en tant qu’alternative aux antibiotiques traditionnels.3 Ce sont des peptides qui présentent des antimicrobiens à large spectre.

activité contre divers pathogènes. Contrairement aux antibiotiques traditionnels,

Les AMP ne ciblent pas les enzymes bactériennes, qui peuvent facilement muter. Bien que

les mécanismes exacts de fonctionnement des AMP ne sont pas complètement clairs,

leur capacité à perméabiliser la membrane de la cellule bactérienne4 a été identifiée avec plusieurs autres cibles.8,9 Depuis leur découverte initiale, des centaines de SAP ont été

catalogué

scientifiques du monde entier et des bases de données sur le Web ont été

Malgré cela, il y a eu peu de succès dans le développement des SAP

Médicaments approuvés par la FDA. Un des rares exemples est le pexiganan, aussi

connu sous le nom MSI-78, qui a atteint les essais cliniques de phase III, mais n’a pas été

approuvé par la FDA en raison du fait qu’il n’était pas plus efficace

que les traitements existants.12 Une difficulté majeure

dans le développement de médicaments AMP est la production.13 AMPs sont généralement isolés de la nature en quantités infimes. Peptide

les méthodologies de synthèse sont trop chères pour fabriquer des AMP sur

l’échelle nécessaire pour les essais cliniques. Utilisation du génie génétique

produire des AMP dans la levure ou les bactéries s’est avéré inefficace

en raison de la toxicité des AMP envers leur hôte d’expression.

Les inconvénients des AMP ont donc motivé le développement de

imitateurs de peptides antimicrobiens (SMAMP), molécules synthétiques conçues

pour capturer les caractéristiques structurelles actives des AMP, telles que l’amphiphilie.

Les SMAMP peuvent présenter une activité antimicrobienne améliorée et sont plus faciles

synthétiser que les AMP en raison de leur structure simplifiée. Exemples

parmi les SMAMP, on trouve des peptoïdes, des peptides 14, des peptides cycliques, 20 polymères synthétiques, 21 oligo-acyl lysines, 25, 26 céragénines, 27 et des oligomères aromatiques. 28 − 33 Dans notre groupe de recherche, nous avons déjà synthétisé des SMAMP possédant

des échafaudages triaryliques liés à des motifs urée, 29 amide, 30 et acétylène34.

Des trois, SMAMPs avec des linkers d’amide s’est avéré être le plus actif,

et l’un d’entre eux a terminé un essai clinique de phase II pour pan-Staph

infections chez les humains. 1,2,3-Triazoles sont couramment utilisés comme bioisostères

d’amides35,36 en chimie médicinale, et en remplaçant

La fonctionnalité de l’amide avec un triazole peut mener à des activités améliorées.37 − 39 Par conséquent, il a semblé raisonnable de déterminer si les SMAMP contenant

Le linker triazole serait également plus actif. De plus, les 1,2,3-triazoles

sont formés via click chimie, qui est très fiable, régiospécifique,

et le groupe fonctionnel tolérant. Au meilleur de notre connaissance, l’utilisation

de la chimie de clic pour créer un échafaudage SMAMP n’a pas été démontré

avant. Par conséquent, nous avons entrepris de synthétiser des SMAMPs de la structure générale 1 (schéma 1) et de caractériser leur

des propriétés antimicrobiennes.Schéma 1 Conception générale synthétique des SMAMP contenant

Triazoles Utilisant

Cliquez sur ChimieDes études précédentes ont été affichées

que le noyau aromatique central et la charge

la densité étaient des paramètres importants dans l’optimisation de l’activité SMAMP33. En conséquence, trois groupes de SMAMP ont été ciblés.

dans cette entreprise. Le premier groupe (SMAMPs 4 – 5) est constitué de SMAMPs avec un anneau central de phényle flanqué de

deux groupes phényle et une charge positive nette de deux ou quatre (figure ​ (figure1) .1). Le deuxième groupe (SMAMPs 6 – 10) est constitué de SMAMP avec un anneau central de naphtyle flanqué

par deux groupes phényles et une charge positive nette allant de deux à

six. Le troisième groupe se compose de SMAMP 11, avec un central

anneau phénanthryle flanqué de deux groupes phényle et une charge nette positive

Quatre groupes de SMAMP étudiés pour leur activité antimicrobienne. Ces SMAMP ont été synthétisés

en faisant réagir deux équivalents d’azide

avec un équivalent de bis-alcyne. Une procédure représentative pour

la synthèse de SMAMP 7 est décrite dans le schéma 2. A partir du dibromure 12, un sonogashira

Réaction40 avec du triméthylsilylacétylène

a donné l’intermédiaire bis-triméthylsilylalkyne en excellent

rendements. L’élimination des groupes triméthylsilyle avec du KF a fourni du bis-alcyne 13. Le fragment d’azoture a été préparé par alkylation de diphénol 14 avec Br (CH2) 3NHBoc, suivi du

conversion du bromure intermédiaire en azoture 15 via

procédures développées par Zhu et Ma.41 Standard

Conditions de cycloaddition 1,3-dipolaires développées par Sharpless et al., 42 utilisant CuSO4 comme source de cuivre

et ascorbate de sodium en tant que réducteur, a donné 16 à 43%

rendement. Le reste du bilan de masse est constitué du produit

dans lequel bis-alcyne 13 a réagi avec un seul équivalent

de l’azide 15 et chauffage supplémentaire à 50 ° C était

nécessaire pour 13 de réagir complètement avec deux équivalents

de 15. Cette différence de réactivité des deux alcynes

les fragments ont permis la synthèse de SMAMP asymétriques tels que 9. Enfin, la déprotection de 16 avec trifluoroacétique

l’acide (TFA) a fourni SMAMP 7 en tant que sel de TFA. Plus loin

les détails pour la synthèse de tous les SMAMP peuvent être trouvés dans les Informations de Soutien. Synthèse 2Synthèse de SMAMP 7 via Click ChemistrySMAMPs 4 – 11 ont été testés

contre

cinq différentes souches de bactéries: Staphylococcus Gram positif

aureus (ATCC 27660) et Enterococcus faecalis (ATCC 29212) et Escherichia coli à Gram négatif (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145),

et Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883). Leur antimicrobien

l’activité a été exprimée en termes de concentration minimale inhibitrice

(MIC). Ces valeurs ont été déterminées selon Hancock ’ s

méthode pour peptides antimicrobiens cationiques, qui est une légère modification

de la méthode de dilution microbroth classique recommandée par le Clinical

et Laboratory Standards Institute (CLSI), et ils ont été mesurés

soit en l’absence ou en présence de 40% de sérum de souris.43,44 La limite supérieure du sérum de souris était de 40%, car la bactérie avait des difficultés

en croissance lorsque le pourcentage a été augmenté davantage. Les résultats sont

montré dans le tableau 1. SMAMPs 4 – 11 possédait un spectre d’activité variable, montrant généralement

valeurs de CMI plus faibles envers S. aureus et E.

coli que E. faecalis, P. aeruginosa et K. pneumoniae. Fait intéressant, SMAMP 10 a montré des valeurs de CMI modestes contre P. aeruginosa, qui est une bactérie difficile à tuer.Tableau 1Antimicrobien

Activités avec et

sans sérum de souris et hémolyse des SMAMPs L’activité hémolytique de SMAMPs vis-à-vis des cellules de mammifères a également été évaluée,

où la possibilité de

induire la lyse dans les érythrocytes humains a été mesurée comme une valeur de HC50, la concentration la plus faible qui provoque 50% de lyse du rouge

cellules sanguines hépatite c. De façon surprenante, les SMAMP 4 ont toutes présenté une activité antimicrobienne plus élevée (valeurs de CMI plus basses) envers S. aureus en présence de 40% de sérum de souris. Ce sérum

l’effet était moins prononcé envers E. coli mais était

toujours observé pour la majorité des SMAMP. Ce résultat était inattendu

car il est bien connu que les antibiotiques sont généralement moins efficaces

lorsqu’il est administré en présence de sérum, comme la liaison des antibiotiques

Les protéines sériques désactivent généralement l’antibiotique45. Svenson et al. avait déjà étudié la liaison de cationique

peptides à l’albumine, et les résultats ont indiqué que la liaison de

peptides à l’albumine abaisse la concentration efficace des peptides

nécessaire pour lutter contre les bactéries.46 D’où la

Les valeurs MIC des peptides ont augmenté en présence d’albumine. Là

sont seulement un nombre limité d’exemples47 − 49 dans lequel une augmentation

dans l’activité antimicrobienne a été observée quand un antibiotique a été administré

en présence de sérum. Les raisons exactes de ce phénomène sont

pas complètement clair. Il a été suggéré précédemment que les changements

dans le pH a abaissé le MIC.50 En outre,

la présence d’autres peptides antibactériens51 dans le sérum ou de facteurs hôtes synergiques non identifiés52 pourrait contribuer à la CMI inférieure observée. Une autre explication

est que le sérum augmente la solubilité ou l’internalisation de l’antibiotique.Plusieurs tendances ont été observées dans l’activité antimicrobienne dans le

présence de sérum de souris et hémolyse des SMAMP 4 – 11. Indépendamment de la taille de l’anneau central dans SMAMPs 11, l’activité antimicrobienne a augmenté

de façon spectaculaire lorsque la charge positive nette est passée de deux (SMAMP 4 et 6) à quatre (SMAMP 5 et 7). Nouvelles augmentations de la charge positive nette à cinq ou six

n’a pas semblé avoir un impact significatif sur l’activité antimicrobienne. le

la taille du noyau aromatique semble avoir un effet proportionnel sur

activité hémolytique mais pas sur les valeurs de CMI. En comparant SMAMP 5 et 8, les deux avec un net positif de quatre, il y a

était environ une augmentation de 12 fois l’activité hémolytique avec le

addition d’un fragment phényle dans le noyau aromatique. L’hémolytique

l’activité variait également avec le modèle de substitution, car le SMAMP 8 ortho-substitué avait un

activité hémolytique que sa contrepartie méta-substituée,

SMAMP 7. L’effet de la charge et de l’hydrophobicité

été précédemment décrit par Str ø m et al. dans le contexte de court

peptides cationiques.53 Ces peptides requis

une charge minimale de +2 pour l’activité antistaphylococcique, alors que notre

SMAMPs 4 – 11 requis une charge minimale

de +4. La présence d’un groupe hydrophobe plus grand a donné des valeurs MIC plus faibles

dans les peptides de Str ø m ’ Cependant, dans ce rapport en augmentation

la taille de l’anneau aromatique central n’a pas eu d’effet significatif

sur les valeurs de MIC.Out de tous ces SMAMPs, 5, 7, et 10 étaient parmi les plus puissants et ont montré

la sélectivité la plus élevée

même comparé au pexiganan, l’AMP le plus étudié à ce jour.

Par exemple, SMAMP 5 est beaucoup plus puissant que la pexiganine

et est environ 10 fois moins hémolytique donnant des valeurs de sélectivité

(HC50 / MIC) de > 2500 et > 160 pour S. aureus et E. coli, respectivement. Quand 5, 7 et 10 ont été comparés à divers SMAMP dans

la littérature, il a été constaté que 5, 7,

et 10 possédaient une meilleure activité antimicrobienne contre S. aureus que la plupart des peptoïdes, -peptides, courtes linéaires

et des peptides cycliques, des polymères synthétiques et des oligo-acyl lysines,

typiquement des valeurs MIC de 2 – 15 μ g / mL.As

un effort pour montrer l’importance du linker 1,2,3-triazole

utilisé dans cette étude, l’activité de SMAMP 7 a été comparée

aux analogues préalablement synthétisés dans notre laboratoire (Tableau 2, SMAMP 17 et 18). Quand

le linker 1,2,3-triazole a été enlevé de l’échafaudage (SMAMP 17 (33)), il y avait un 4 x 820 fois;

diminution de l’activité antimicrobienne vis-à-vis de S. aureus et diminution de 4 fois vers E. coli en présence

de sérum de souris. De plus, l’activité hémolytique était d’environ

quatre fois plus élevé. Lorsque le linker 1,2,3-triazole a été remplacé par

une fraction acétylène (SMAMP 18), encore une diminution significative

dans l’activité antimicrobienne envers S. aureus dans

la présence de sérum de souris a été observée ainsi qu’une valeur inférieure de HC50. Dans l’ensemble, la présence du linker 1,2,3-triazole activé

SMAMP 7 pour surpasser les analogues avec d’autres linkers

termes de l’activité antimicrobienne et hémolytique. Tableau 2 Effet de la

Activités antimicrobiennes et hémolytiques des SMAMP En conclusion, le premier exemple d’utilisation du clic

la chimie à

générer un échafaudage SMAMP a été signalé. La taille du noyau aromatique

et le nombre et le motif de substitution des groupes ammonium étaient

varié; les effets de ces variables sur SMAMP antimicrobien et

les activités hémolytiques ont été mesurées. Tous les SMAMP avaient un taux d’antimicrobiens supérieur

activités lorsqu’elles sont administrées en présence de sérum de souris et exposées

activité antimicrobienne plus élevée envers S. aureus par rapport à E. coli. Les SMAMP 5, 7 et 10 possédaient des activités antimicrobiennes comparables à celles de S. aureus en tant que SMAMPs les plus puissants rapportés dans la littérature.

tout en maintenant une activité hémolytique plus faible. L’importance de la

linker a également été étudié en comparant 7 à 17 – 18, et une différence marquée dans

activités antimicrobiennes et hémolytiques ont été observées, validant ainsi

l’utilisation de la fraction 1,2,3-triazole. À la suite de cette étude, nous

ont identifié trois SMAMP, 5, 7 et 10, qui ont surpassé pexiganan, et ils sont actuellement

étudiés pour utilisation comme nouveaux antibiotiques.

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