Développement d’inhibiteurs puissants et sélectifs de S. aureus Sortase A à base de macrocycles peptidiques

d’antibiotique

la résistance parmi les pathogènes humains menaçant la vie a incité le

l’exploration de nouvelles cibles alternatives au-delà de celles exploitées par les

antibiotiques. Une classe attrayante de cibles sont les sortases, qui

sont transpeptidases membranaires qui catalysent le transfert et

immobilisation covalente des protéines de surface à la paroi cellulaire chez Gram-positif

bacteries.1 − 3 Par exemple, SrtA des ancres de S. aureus

un certain nombre de facteurs de virulence importants tels que la protéine A, agglomérant

Les facteurs de virulence sont sécrétés en tant que précurseurs.

avec des signaux de tri C-terminal “ LPXTG ” qui sont clivés

par SrtA entre les résidus de threonine et de glycine et ligaturés à la polyglycine

séquences de peptidoglycanes dans la couche de cellules bactériennes.5 Ces protéines permettent l’adhésion et l’infection

des cellules et tissus hôtes, évasion du système immunitaire et biofilm

formation.6,7 SrtA de S. aureus a reçu

beaucoup d’attention parce que ce pathogène cliniquement important a développé

résistance à la plupart des antibiotiques disponibles.8,9 knockouts SrtA montrent réduit

adhérence aux protéines de la matrice et pathogénicité réduite dans les modèles animaux

pour S. aureus.10 − 13De grands efforts ont été faits pour développer des inhibiteurs de la SrtA

au cours des dernières années.1,2 Bibliothèques de petites molécules organiques

comprenant 30 000,14 135,625,15 et 50,24016 chimique

les structures ont été criblées pour l’inhibition de SrtA.

Les composés les plus actifs identifiés sont des inhibiteurs covalents

réagissent avec le groupe thiol du site actif Cys 184 de SrtA. Tandis que

ayant de bonnes IC50 dans la gamme submicromolaire, ils

avoir une mauvaise sélectivité de la cible. Les inhibiteurs réversibles les plus actifs

ont des valeurs IC50 micromolaires faibles.2,17,18 Un effort récent combinant le criblage in silico et l’optimisation a produit un inhibiteur de SrtA réversible basé

sur un échafaudage triazolothiadiazole avec une CI50 à un chiffre (9.3 μ M) .19 L’application de

techniques d’affichage telles que l’affichage de l’ARNm pour cribler des milliards de peptides

a jusqu’à présent donné que des liants de SrtA, mais pas d’inhibiteurs.20 Alors que de plus en plus d’inhibiteurs de SrtA

de meilleures activités inhibitrices sont rapportées, les meilleurs inhibiteurs réversibles

ont toujours des valeurs Ki

dans la gamme micromolaire. De telles affinités plutôt faibles nécessitent une application

de fortes concentrations pour l’intervention thérapeutique, augmentant ainsi

le risque de toxicité dû à la liaison hors cible. Il y a un besoin évident

de nouveaux inhibiteurs de SrtA avec une meilleure affinité et une sélectivité cible plus élevée.Herein, nous avons proposé de développer des inhibiteurs de SrtA basés sur bicyclic

peptides parce que les molécules de ce format peuvent lier des cibles avec une forte

affinité et sélectivité de la cible. Les peptides bicycliques contiennent deux peptides

anneaux qui peuvent se lier à des cibles protéiques un peu comme les anticorps se lier à

antigènes via leurs régions déterminant la complémentarité.21 Les peptides bicycliques avec des spécificités de liaison adaptées

peut être développé par phage display.22 Tous

peptides bicycliques développés jusqu’à présent avec cette approche affiché élevé

sélectivité cible.21 − 24 Par exemple, un inhibiteur peptidique bicyclique de la sérine protéase humaine

L’uPA (Ki = 53 nM) était

> 1000 fois sélectif sur son orthologue murin et paralogue

protéases.21 De même, les peptides bicycliques

contre les cibles

la kallikréine plasmatique et la FXIIa ont montré une sélectivité égale ou même plus élevée.23,24 Étude des structures cocristallines des peptides bicycliques et de leurs cibles

a montré que les peptides adaptent leurs formes pour être parfaitement complémentaires

à la cible.21,25 Nous avons raisonné que le peptide bicyclique

inhibiteurs, étant très sélectif pour SrtA, pourrait être utile comme outil

composés dans les études avec SrtA et potentiellement servir de pistes pour

le développement de médicaments anti-infectieux peptidomimétiques.Combinatoire

des banques de peptides ayant le format ACXmCXnCG (C = cystéine, X = acides aminés aléatoires, m, n = nombre

d’acides aminés aléatoires) ont été présentés sur le phage et cyclisés en réagissant

les cystéines avec le 1,3,5-tris (bromométhyl) benzène (TBMB), comme précédemment

décrit.22,26 Trois bibliothèques étaient en parallèle

soumis à des sélections d’affinité avec SrtA: Library A contenu bicyclique

peptides avec 7 – 8 résidus aléatoires (m × n = 3 × 4,

4 × 3, 3 × 5, 5 × 3, 4 × 4), la bibliothèque B contenue

peptides avec 9 résidus aléatoires (4 × 5, 5 × 4, 3 ×

6, 6 × 3) et la bibliothèque 6 × 6 peptides bicycliques contenus

avec 12 résidus aléatoires (6 × 6) (Figure ​ Figure11A). Après trois tours de sélection, plusieurs

des douzaines de clones ont été analysés par séquençage de Sanger (figure ​ figure 11B). Une séquence consensus forte

indiqué que les peptides spécifiques de la cible ont été isolés. Haut débit

séquençage (HTS) a ensuite été appliqué pour obtenir un

image de peptides enrichis. Les 20 clones les plus abondants sont montrés

dans Figure ​ Figure11C et plus

clones dans les tableaux S1 – S3, Informations à l’appui. Presque tous les peptides isolés des bibliothèques A et B contenaient

motif d’acides aminés “ LPP ” (98% et 99% des peptides,

respectivement). Le “ LPP ” motif est similaire au tri

séquence “ LPXTG ” des substrats naturels reconnus

et clivé par SrtA.5 Le motif était présent

le plus souvent dans des anneaux de cinq acides aminés (sans compter le flanc

cystéines) et adjacentes à la seconde cystéine (CXXLPPC). Cela a été trouvé

plus souvent dans le premier des deux anneaux. Analyse des données HTS

également montré des préférences d’acides aminés dans les deux positions en face de

le motif LPP. En première position, la proline a été retrouvée le plus souvent

(30%), et en deuxième position, la leucine, la glutamine et la valine

étaient les acides aminés les plus fréquents (21, 18 et 14%). Dans les inhibiteurs de SrtA

avec le “ PQ / LLPP ” motif dans le

premier anneau, le deuxième anneau n’a pas convergé vers une séquence spécifique rebond.

En revanche, dans le groupe de peptides avec le “ PQ / LLPP ” motif dans le deuxième anneau, certains amino

acides dans certaines positions dans le premier anneau semble être légèrement

préféré (Figure ​ Figure11C et Tableaux S1 – S3, Informations complémentaires). Peptides isolés du 6 × 6 bibliothèque a convergé vers soit

de deux motifs de consensus: le premier contenait une quatrième cystéine et

la séquence consensus “ ACXXK / RXVCCL / VXXD / EXXCG ” et

la seconde contenait le “ LPP ” motif dans l’un des

deux anneaux. Des études antérieures dans notre laboratoire ont montré que les peptides

ayant quatre résidus de cystéine ont été probablement isolés sous la forme de

peptides bicycliques avec deux ponts disulfure.27 Les peptides avec des cystéines non modifiées peuvent s’oxyder pendant la préparation des phages

ou sélection d’affinité. Bien que la fraction de peptide non modifié

est généralement faible, les peptides avec deux ponts disulfure peuvent être enrichis

dans les cas où ils se lient particulièrement bien à la protéine cible.Figure 1Phage

sélection de peptides bicycliques contre S. aureus SrtA.

(A) Format des bibliothèques. (B) Les peptides ont été séquencés après

trois sélections par séquençage de Sanger. Similitudes de séquence

sont mis en évidence par la couleur. Les constantes inhibitrices Kis ont été déterminées … Treize peptides bicycliques identifiés

par séquençage de Sanger

ont été synthétisés et l’inhibition de SrtA testé dans un système enzymatique

dosage en utilisant le substrat trempé par fluorescence Dabcyl-LPETG-Edans.

Tous les peptides contenant le “ LPP ” motif, mais pas ceux

contenant les quatre cystéines, SrtA bloqué (figure ​ figure 11B). Les deux meilleurs peptides bicycliques 1 (ACPQLPPCRVSCG) et 2 (ACTQRCPQLPPCG) ont inhibé SrtA avec Kis de 4,3 ± 0,3 et 2,4

± 0,3 μ M, respectivement (Figure ​ Figure22A). La liaison de ces peptides à SrtA

avec une affinité micromolaire à un chiffre a été confirmée dans un test de liaison

basé sur la polarisation de fluorescence. Les peptides marqués au N-terminal

groupes amino avec SrtA lié à la fluorescéine avec des valeurs de Kd de 8,8 ± 0,7 et 1,5 ± 0.1 μ M, respectivement

(Figure ​ Figure 22B). Les deux peptides

contenait le motif étendu “ PQLPP &#x0201d ;; le peptide 1 dans le premier cycle et le peptide 2 dans le second

bague. Un peptide monocyclique contenant le “ PQLPP ” motif

a été synthétisé pour tester si le second anneau contribue à la liaison

(Figure ​ Figure 22A; 3). Le peptide ACPQLPPCG cyclisé par le 1,3-bis (bromométhyl) benzène (BBMB) inhibe SrtA

avec un Ki de 4,9 ±

0,5 μ M et ainsi fait avec une puissance similaire au peptide bicyclique 1 et 2 fois plus faible que le peptide bicyclique 2.

Alanine scans dans les anneaux du peptide bicyclique 1 et

peptide bicyclique 2 ne contenant pas le motif consensus

ont été réalisées pour évaluer dans quelle mesure les différents acides aminés

contribuer à la liaison, voire pas du tout (Figure ​ Figure 22C). Dans le peptide bicyclique 1, substitution

des trois acides aminés à l’alanine n’a pas réduit l’inhibiteur

activité, suggérant que le second anneau n’interagissait pas avec

la cible. En revanche, dans le peptide bicyclique 2, amino

la substitution d’acide a réduit l’activité inhibitrice de manière substantielle. Mutation

de Gln4 et Arg5 à Ala abaissé l’activité 7 et 22 fois, respectivement

(Figure ​ Figure 22C). L’importance

d’Arg5 est conforme à la constatation que l’arginine était enrichie en

position 5 des nombreux peptides identifiés par haut débit

séquençage. Ces données suggèrent que les peptides avec le motif consensus

“ PQLPP ” dans la deuxième bague peut former des contacts avec SrtA

via les acides aminés du premier anneau. Le séquençage à haut débit

ensemble de données a ensuite été recherché plus de peptides avec le consensus

motif “ PQLPP ” dans le deuxième anneau. Le plus abondant

les peptides de ce type étaient le peptide bicyclique 4 (ACTSRCPQLPPCG;

trouvé 105 fois) et le peptide bicyclique 5 (ACHSRCPQLPPCG;

trouvé 55 fois). Ils inhibaient SrtA avec des valeurs de Ki de 1,8 ± 0,17 et 1,1 ± 0,18 μ M.

Il est probable que l’affinité des peptides avec le “ PQLPP ”

dans la deuxième bague peut être encore améliorée en optimisant tous les trois

acides aminés dans le premier cycle et que les inhibiteurs de la peptide SrtA bicycliques

avec la puissance nanomolaire peut être généré. Tester les activités de

peptides bicycliques plus abondants identifiés par haut débit

le séquençage a donné un autre peptide avec une haute affinité, le peptide bicyclique 6 avec un Ki de

1,5 ± 0,4 μ M (Figure ​ Figure11C). Compte tenu de la similitude de la “ LPP ”

motif sur le substrat de la sortase “ LPXTG &#x0201d ;, la capacité

de SrtA pour cliver les peptides bicycliques a été testé. Après l’incubation

du peptide bicyclique 2 (0,5 mM) avec SrtA à haute concentration

(0,2 mM), aucun clivage du peptide bicyclique n’a été observé (Figure

S1, Informations à l’appui). La cible

la spécificité des peptides bicycliques a été évaluée en testant la liaison

à un panel de protéines, y compris la sérum albumine, O6-alkylguanine-ADN

alkyltransférase et TEV protéase, tous ayant une surface accessible

résidu de cystéine. Les peptides bicycliques ne se sont liés à aucun des

protéines, indiquant une sélectivité élevée de la cible (Figure S2, Informations de support) .Figure 2Structure and activity

des inhibiteurs de peptide SrtA bicycliques. (UNE)

Structures chimiques des peptides macrocycles 1, 2 et 3. (B) Liaison de la fluorescéine

peptides bicycliques 1 et 2 à SrtA mesurés

par polarisation de fluorescence. Valeurs moyennes et standard … L’activité de SrtA sur S. aureus peut être

mesuré

avec des peptides marqués par fluorescence contenant la séquence de LPETG.

Les fluorophores de tels substrats, lorsqu’ils sont ajoutés à la culture, sont

incorporé dans la paroi cellulaire de S. aureus par SrtA.28,29 Nous avons synthétisé un substrat LPETG marqué à la fluorescéine et analysé

son incorporation dans la paroi cellulaire en présence d’un peptide bicyclique.

Le macrocycle inhibe efficacement l’incorporation du substrat

d’une manière dépendant de la concentration avec une CI50 de 167

μ M (Figure ​ Figure 33).

A la concentration la plus élevée utilisée (1 mM), le transfert de fluorescent

peptide à la couche bactérienne était presque aussi faible que dans le SKM12 SrtA

souche knock-out. Comparé à la valeur de Ki dans la gamme micromolaire faible mesurée in vitro, la CI50 de 167 μ M dans le test cellulaire était plutôt

haute. Les explications potentielles étaient la dégradation protéolytique de l’inhibiteur

ou diffusion inefficace du peptide macrocycle dans la bactérie

paroi cellulaire. Peptide bicyclique incubé pendant la nuit dans des surnageants de S. aureus Les cultures de Newman ont inhibé le clivage du fluorogène.

substrat par SrtA avec l’activité attendue, montrant que sa fonctionnalité

n’a pas été altérée par le clivage protéolytique. Cette expérience a également montré

que l’activité inhibitrice des peptides bicycliques n’a pas été affectée

par n’importe quel composant dans le surnageant bactérien. Diffusion inefficace

du peptide bicyclique à SrtA dans la couche bactérienne est restée la

raison la plus probable pour le IC50 relativement élevé. Figure 3Inhibition

de l’incorporation médiée par SrtA de fluorescent synthétique

substrat dans la paroi cellulaire. Signal de fluorescence des cellules de S. aureus Newman cultivées pendant 24 h en présence des concentrations indiquées

du peptide bicyclique 5. Les cellules ont été lavées avant … En résumé, nous avons généré SrtA

inhibiteurs avec des constantes Ki près de

1 μ M, étant nettement meilleur

que les meilleurs inhibiteurs sélectifs de la petite molécule SrtA développés de manière

loin. La clé pour obtenir des inhibiteurs plus puissants était le choix d’un

un format de molécule différent, celui des macrocycles. Macrocycles peptidiques

avoir une taille plus grande que les petites molécules, leur permettant de former plus

interactions moléculaires avec des cibles protéiques et par conséquent lier

plus étroitement. Une autre clé dans le développement de meilleurs inhibiteurs de SrtA

était le dépistage d’un grand nombre de molécules. Avec l’affichage des phages

approche, plusieurs milliards de macrocycles peptidiques différents pourraient être échantillonnés

dans un court laps de temps. Comparé aux écrans à haut débit de petites molécules

réalisée avant, une bibliothèque de composés d’environ 10 000 fois plus était

échantillonné dans ce travail. Au meilleur de nos connaissances, les peptides macrocycles

développés ici sont les inhibiteurs de SrtA non covalents les plus puissants rapportés

jusque là. Étant donné qu’ils interagissent à travers des contacts spécifiques

avec le site actif de SrtA, il est probable que ces molécules vont

devenir des composés d’outils pour étudier la fonction biologique de

SrtA. En outre, les peptides macrocycles, et en particulier les

plus petit monocyclique, peut servir de structures principales pour le développement

de médicaments anti-infectieux peptidomimétiques.

Tu peux Aussi comme