d’antibiotique
la résistance parmi les pathogènes humains menaçant la vie a incité le
l’exploration de nouvelles cibles alternatives au-delà de celles exploitées par les
antibiotiques. Une classe attrayante de cibles sont les sortases, qui
sont transpeptidases membranaires qui catalysent le transfert et
immobilisation covalente des protéines de surface à la paroi cellulaire chez Gram-positif
bacteries.1 − 3 Par exemple, SrtA des ancres de S. aureus
un certain nombre de facteurs de virulence importants tels que la protéine A, agglomérant
Les facteurs de virulence sont sécrétés en tant que précurseurs.
avec des signaux de tri C-terminal “ LPXTG ” qui sont clivés
par SrtA entre les résidus de threonine et de glycine et ligaturés à la polyglycine
séquences de peptidoglycanes dans la couche de cellules bactériennes.5 Ces protéines permettent l’adhésion et l’infection
des cellules et tissus hôtes, évasion du système immunitaire et biofilm
formation.6,7 SrtA de S. aureus a reçu
beaucoup d’attention parce que ce pathogène cliniquement important a développé
résistance à la plupart des antibiotiques disponibles.8,9 knockouts SrtA montrent réduit
adhérence aux protéines de la matrice et pathogénicité réduite dans les modèles animaux
pour S. aureus.10 − 13De grands efforts ont été faits pour développer des inhibiteurs de la SrtA
au cours des dernières années.1,2 Bibliothèques de petites molécules organiques
comprenant 30 000,14 135,625,15 et 50,24016 chimique
les structures ont été criblées pour l’inhibition de SrtA.
Les composés les plus actifs identifiés sont des inhibiteurs covalents
réagissent avec le groupe thiol du site actif Cys 184 de SrtA. Tandis que
ayant de bonnes IC50 dans la gamme submicromolaire, ils
avoir une mauvaise sélectivité de la cible. Les inhibiteurs réversibles les plus actifs
ont des valeurs IC50 micromolaires faibles.2,17,18 Un effort récent combinant le criblage in silico et l’optimisation a produit un inhibiteur de SrtA réversible basé
sur un échafaudage triazolothiadiazole avec une CI50 à un chiffre (9.3 μ M) .19 L’application de
techniques d’affichage telles que l’affichage de l’ARNm pour cribler des milliards de peptides
a jusqu’à présent donné que des liants de SrtA, mais pas d’inhibiteurs.20 Alors que de plus en plus d’inhibiteurs de SrtA
de meilleures activités inhibitrices sont rapportées, les meilleurs inhibiteurs réversibles
ont toujours des valeurs Ki
dans la gamme micromolaire. De telles affinités plutôt faibles nécessitent une application
de fortes concentrations pour l’intervention thérapeutique, augmentant ainsi
le risque de toxicité dû à la liaison hors cible. Il y a un besoin évident
de nouveaux inhibiteurs de SrtA avec une meilleure affinité et une sélectivité cible plus élevée.Herein, nous avons proposé de développer des inhibiteurs de SrtA basés sur bicyclic
peptides parce que les molécules de ce format peuvent lier des cibles avec une forte
affinité et sélectivité de la cible. Les peptides bicycliques contiennent deux peptides
anneaux qui peuvent se lier à des cibles protéiques un peu comme les anticorps se lier à
antigènes via leurs régions déterminant la complémentarité.21 Les peptides bicycliques avec des spécificités de liaison adaptées
peut être développé par phage display.22 Tous
peptides bicycliques développés jusqu’à présent avec cette approche affiché élevé
sélectivité cible.21 − 24 Par exemple, un inhibiteur peptidique bicyclique de la sérine protéase humaine
L’uPA (Ki = 53 nM) était
> 1000 fois sélectif sur son orthologue murin et paralogue
protéases.21 De même, les peptides bicycliques
contre les cibles
la kallikréine plasmatique et la FXIIa ont montré une sélectivité égale ou même plus élevée.23,24 Étude des structures cocristallines des peptides bicycliques et de leurs cibles
a montré que les peptides adaptent leurs formes pour être parfaitement complémentaires
à la cible.21,25 Nous avons raisonné que le peptide bicyclique
inhibiteurs, étant très sélectif pour SrtA, pourrait être utile comme outil
composés dans les études avec SrtA et potentiellement servir de pistes pour
le développement de médicaments anti-infectieux peptidomimétiques.Combinatoire
des banques de peptides ayant le format ACXmCXnCG (C = cystéine, X = acides aminés aléatoires, m, n = nombre
d’acides aminés aléatoires) ont été présentés sur le phage et cyclisés en réagissant
les cystéines avec le 1,3,5-tris (bromométhyl) benzène (TBMB), comme précédemment
décrit.22,26 Trois bibliothèques étaient en parallèle
soumis à des sélections d’affinité avec SrtA: Library A contenu bicyclique
peptides avec 7 – 8 résidus aléatoires (m × n = 3 × 4,
4 × 3, 3 × 5, 5 × 3, 4 × 4), la bibliothèque B contenue
peptides avec 9 résidus aléatoires (4 × 5, 5 × 4, 3 ×
6, 6 × 3) et la bibliothèque 6 × 6 peptides bicycliques contenus
avec 12 résidus aléatoires (6 × 6) (Figure Figure11A). Après trois tours de sélection, plusieurs
des douzaines de clones ont été analysés par séquençage de Sanger (figure figure 11B). Une séquence consensus forte
indiqué que les peptides spécifiques de la cible ont été isolés. Haut débit
séquençage (HTS) a ensuite été appliqué pour obtenir un
image de peptides enrichis. Les 20 clones les plus abondants sont montrés
dans Figure Figure11C et plus
clones dans les tableaux S1 – S3, Informations à l’appui. Presque tous les peptides isolés des bibliothèques A et B contenaient
motif d’acides aminés “ LPP ” (98% et 99% des peptides,
respectivement). Le “ LPP ” motif est similaire au tri
séquence “ LPXTG ” des substrats naturels reconnus
et clivé par SrtA.5 Le motif était présent
le plus souvent dans des anneaux de cinq acides aminés (sans compter le flanc
cystéines) et adjacentes à la seconde cystéine (CXXLPPC). Cela a été trouvé
plus souvent dans le premier des deux anneaux. Analyse des données HTS
également montré des préférences d’acides aminés dans les deux positions en face de
le motif LPP. En première position, la proline a été retrouvée le plus souvent
(30%), et en deuxième position, la leucine, la glutamine et la valine
étaient les acides aminés les plus fréquents (21, 18 et 14%). Dans les inhibiteurs de SrtA
avec le “ PQ / LLPP ” motif dans le
premier anneau, le deuxième anneau n’a pas convergé vers une séquence spécifique rebond.
En revanche, dans le groupe de peptides avec le “ PQ / LLPP ” motif dans le deuxième anneau, certains amino
acides dans certaines positions dans le premier anneau semble être légèrement
préféré (Figure Figure11C et Tableaux S1 – S3, Informations complémentaires). Peptides isolés du 6 × 6 bibliothèque a convergé vers soit
de deux motifs de consensus: le premier contenait une quatrième cystéine et
la séquence consensus “ ACXXK / RXVCCL / VXXD / EXXCG ” et
la seconde contenait le “ LPP ” motif dans l’un des
deux anneaux. Des études antérieures dans notre laboratoire ont montré que les peptides
ayant quatre résidus de cystéine ont été probablement isolés sous la forme de
peptides bicycliques avec deux ponts disulfure.27 Les peptides avec des cystéines non modifiées peuvent s’oxyder pendant la préparation des phages
ou sélection d’affinité. Bien que la fraction de peptide non modifié
est généralement faible, les peptides avec deux ponts disulfure peuvent être enrichis
dans les cas où ils se lient particulièrement bien à la protéine cible.Figure 1Phage
sélection de peptides bicycliques contre S. aureus SrtA.
(A) Format des bibliothèques. (B) Les peptides ont été séquencés après
trois sélections par séquençage de Sanger. Similitudes de séquence
sont mis en évidence par la couleur. Les constantes inhibitrices Kis ont été déterminées … Treize peptides bicycliques identifiés
par séquençage de Sanger
ont été synthétisés et l’inhibition de SrtA testé dans un système enzymatique
dosage en utilisant le substrat trempé par fluorescence Dabcyl-LPETG-Edans.
Tous les peptides contenant le “ LPP ” motif, mais pas ceux
contenant les quatre cystéines, SrtA bloqué (figure figure 11B). Les deux meilleurs peptides bicycliques 1 (ACPQLPPCRVSCG) et 2 (ACTQRCPQLPPCG) ont inhibé SrtA avec Kis de 4,3 ± 0,3 et 2,4
± 0,3 μ M, respectivement (Figure Figure22A). La liaison de ces peptides à SrtA
avec une affinité micromolaire à un chiffre a été confirmée dans un test de liaison
basé sur la polarisation de fluorescence. Les peptides marqués au N-terminal
groupes amino avec SrtA lié à la fluorescéine avec des valeurs de Kd de 8,8 ± 0,7 et 1,5 ± 0.1 μ M, respectivement
(Figure Figure 22B). Les deux peptides
contenait le motif étendu “ PQLPP ” ;; le peptide 1 dans le premier cycle et le peptide 2 dans le second
bague. Un peptide monocyclique contenant le “ PQLPP ” motif
a été synthétisé pour tester si le second anneau contribue à la liaison
(Figure Figure 22A; 3). Le peptide ACPQLPPCG cyclisé par le 1,3-bis (bromométhyl) benzène (BBMB) inhibe SrtA
avec un Ki de 4,9 ±
0,5 μ M et ainsi fait avec une puissance similaire au peptide bicyclique 1 et 2 fois plus faible que le peptide bicyclique 2.
Alanine scans dans les anneaux du peptide bicyclique 1 et
peptide bicyclique 2 ne contenant pas le motif consensus
ont été réalisées pour évaluer dans quelle mesure les différents acides aminés
contribuer à la liaison, voire pas du tout (Figure Figure 22C). Dans le peptide bicyclique 1, substitution
des trois acides aminés à l’alanine n’a pas réduit l’inhibiteur
activité, suggérant que le second anneau n’interagissait pas avec
la cible. En revanche, dans le peptide bicyclique 2, amino
la substitution d’acide a réduit l’activité inhibitrice de manière substantielle. Mutation
de Gln4 et Arg5 à Ala abaissé l’activité 7 et 22 fois, respectivement
(Figure Figure 22C). L’importance
d’Arg5 est conforme à la constatation que l’arginine était enrichie en
position 5 des nombreux peptides identifiés par haut débit
séquençage. Ces données suggèrent que les peptides avec le motif consensus
“ PQLPP ” dans la deuxième bague peut former des contacts avec SrtA
via les acides aminés du premier anneau. Le séquençage à haut débit
ensemble de données a ensuite été recherché plus de peptides avec le consensus
motif “ PQLPP ” dans le deuxième anneau. Le plus abondant
les peptides de ce type étaient le peptide bicyclique 4 (ACTSRCPQLPPCG;
trouvé 105 fois) et le peptide bicyclique 5 (ACHSRCPQLPPCG;
trouvé 55 fois). Ils inhibaient SrtA avec des valeurs de Ki de 1,8 ± 0,17 et 1,1 ± 0,18 μ M.
Il est probable que l’affinité des peptides avec le “ PQLPP ”
dans la deuxième bague peut être encore améliorée en optimisant tous les trois
acides aminés dans le premier cycle et que les inhibiteurs de la peptide SrtA bicycliques
avec la puissance nanomolaire peut être généré. Tester les activités de
peptides bicycliques plus abondants identifiés par haut débit
le séquençage a donné un autre peptide avec une haute affinité, le peptide bicyclique 6 avec un Ki de
1,5 ± 0,4 μ M (Figure Figure11C). Compte tenu de la similitude de la “ LPP ”
motif sur le substrat de la sortase “ LPXTG ” ;, la capacité
de SrtA pour cliver les peptides bicycliques a été testé. Après l’incubation
du peptide bicyclique 2 (0,5 mM) avec SrtA à haute concentration
(0,2 mM), aucun clivage du peptide bicyclique n’a été observé (Figure
S1, Informations à l’appui). La cible
la spécificité des peptides bicycliques a été évaluée en testant la liaison
à un panel de protéines, y compris la sérum albumine, O6-alkylguanine-ADN
alkyltransférase et TEV protéase, tous ayant une surface accessible
résidu de cystéine. Les peptides bicycliques ne se sont liés à aucun des
protéines, indiquant une sélectivité élevée de la cible (Figure S2, Informations de support) .Figure 2Structure and activity
des inhibiteurs de peptide SrtA bicycliques. (UNE)
Structures chimiques des peptides macrocycles 1, 2 et 3. (B) Liaison de la fluorescéine
peptides bicycliques 1 et 2 à SrtA mesurés
par polarisation de fluorescence. Valeurs moyennes et standard … L’activité de SrtA sur S. aureus peut être
mesuré
avec des peptides marqués par fluorescence contenant la séquence de LPETG.
Les fluorophores de tels substrats, lorsqu’ils sont ajoutés à la culture, sont
incorporé dans la paroi cellulaire de S. aureus par SrtA.28,29 Nous avons synthétisé un substrat LPETG marqué à la fluorescéine et analysé
son incorporation dans la paroi cellulaire en présence d’un peptide bicyclique.
Le macrocycle inhibe efficacement l’incorporation du substrat
d’une manière dépendant de la concentration avec une CI50 de 167
μ M (Figure Figure 33).
A la concentration la plus élevée utilisée (1 mM), le transfert de fluorescent
peptide à la couche bactérienne était presque aussi faible que dans le SKM12 SrtA
souche knock-out. Comparé à la valeur de Ki dans la gamme micromolaire faible mesurée in vitro, la CI50 de 167 μ M dans le test cellulaire était plutôt
haute. Les explications potentielles étaient la dégradation protéolytique de l’inhibiteur
ou diffusion inefficace du peptide macrocycle dans la bactérie
paroi cellulaire. Peptide bicyclique incubé pendant la nuit dans des surnageants de S. aureus Les cultures de Newman ont inhibé le clivage du fluorogène.
substrat par SrtA avec l’activité attendue, montrant que sa fonctionnalité
n’a pas été altérée par le clivage protéolytique. Cette expérience a également montré
que l’activité inhibitrice des peptides bicycliques n’a pas été affectée
par n’importe quel composant dans le surnageant bactérien. Diffusion inefficace
du peptide bicyclique à SrtA dans la couche bactérienne est restée la
raison la plus probable pour le IC50 relativement élevé. Figure 3Inhibition
de l’incorporation médiée par SrtA de fluorescent synthétique
substrat dans la paroi cellulaire. Signal de fluorescence des cellules de S. aureus Newman cultivées pendant 24 h en présence des concentrations indiquées
du peptide bicyclique 5. Les cellules ont été lavées avant … En résumé, nous avons généré SrtA
inhibiteurs avec des constantes Ki près de
1 μ M, étant nettement meilleur
que les meilleurs inhibiteurs sélectifs de la petite molécule SrtA développés de manière
loin. La clé pour obtenir des inhibiteurs plus puissants était le choix d’un
un format de molécule différent, celui des macrocycles. Macrocycles peptidiques
avoir une taille plus grande que les petites molécules, leur permettant de former plus
interactions moléculaires avec des cibles protéiques et par conséquent lier
plus étroitement. Une autre clé dans le développement de meilleurs inhibiteurs de SrtA
était le dépistage d’un grand nombre de molécules. Avec l’affichage des phages
approche, plusieurs milliards de macrocycles peptidiques différents pourraient être échantillonnés
dans un court laps de temps. Comparé aux écrans à haut débit de petites molécules
réalisée avant, une bibliothèque de composés d’environ 10 000 fois plus était
échantillonné dans ce travail. Au meilleur de nos connaissances, les peptides macrocycles
développés ici sont les inhibiteurs de SrtA non covalents les plus puissants rapportés
jusque là. Étant donné qu’ils interagissent à travers des contacts spécifiques
avec le site actif de SrtA, il est probable que ces molécules vont
devenir des composés d’outils pour étudier la fonction biologique de
SrtA. En outre, les peptides macrocycles, et en particulier les
plus petit monocyclique, peut servir de structures principales pour le développement
de médicaments anti-infectieux peptidomimétiques.