L’utilisation combinée de Mycobacterium tuberculosis-Réponses CD spécifiques et CD T-Cell est un puissant outil de diagnostic de la tuberculose active

Un dosage multiparamétrique en cytométrie de flux évaluant les réponses des lymphocytes T spécifiques à Mycobacterium tuberculosis et la combinaison des réponses des lymphocytes T CD et CD avec une discrimination précise entre la tuberculose active et l’infection latente

diagnostic, maladie tuberculeuse active, infection latente Mtb, profil fonctionnel, cellules T CDTuberculose représente une menace majeure pour la santé publique avec & gt; Le développement récent de tests multiplexés en protéomique, transcriptomique ou métabolomique peut constituer la base du développement Des outils pour le diagnostic actif de la tuberculose En plus des tests de biologie moléculaire, des observations récentes ont montré que des mesures immunologiques peuvent être utiles au diagnostic de la tuberculose active. Nous avons récemment montré en cytométrie en flux que le profil cytokinique de Mycobacterium tuberculosis En outre, conformément à une étude antérieure , nous avons récemment confirmé que les réponses des lymphocytes T CD spécifiques de Mtb étaient prédominantes chez les patients avec un taux actif de lymphocytes T cytotoxiques. la tuberculose par rapport à ceux avec LTBI% Sur la base de ces observations précédentes, nous avons émis l’hypothèse que l’évaluation combinée des réponses lymphocytaires T CD et CD spécifiques Mtb pourrait améliorer le diagnostic de la tuberculose activePour tester notre hypothèse de travail, nous avons analysé le profil réponses lymphocytaires T CD spécifiques et la présence de réponses T CD spécifiques à Mtb chez les sujets atteints de tuberculose active ou LTBI, et effectué une analyse de régression multivariée pour évaluer leur capacité relative ou combinée pour distinguer la tuberculose active de l’infection latenteLes résultats montrent que Cependant, la combinaison des deux mesures a grandement amélioré la puissance de ce test basé sur la cytométrie de flux dans le diagnostic de la tuberculose active.

Méthodes

Groupes d’étude

Des patients atteints de tuberculose active ont déjà été décrits maladie de parkinson. Tableau supplémentaire Trente avait un diagnostic basé sur l’isolement en laboratoire de Mtb sur culture mycobactérienne à partir d’expectorations, de liquide de lavage broncho-alvéolaire ou de biopsies cutanées et / ou de test tuberculinique, ELISpot enzyme-linked immunospot et / ou réaction en chaîne de la polymérase comme décrit ailleurs Cinq patients atteints de tuberculose clinique, culture négative ont présenté des symptômes spécifiques et des signes radiologiques de lésions évocatrices de tuberculose et ont répondu au traitement, et les patients avaient un diagnostic basé sur le test GeneXpert ,] et étaient asymptomatiques et avaient des réponses de lymphocytes T spécifiques à ESAT- et / ou CFP- détectées par ELISpot et / ou par coloration intracellulaire par cytokine [ICS] Les sujets avec LTBI étaient soit des agents de santé régulièrement examinés au CHUV Centre Hospitalier Universitaire Vaudois ou ont été étudiés pour l’infection Mtb avant l’initiation de l’anti-tum Traitement des anticorps anti-TNF alpha et nécrose alpha et radiographies thoraciques négatives pour les lésions pulmonaires Des échantillons de sujets atteints de tuberculose active et de LTBI ont été obtenus, traités, conservés et analysés de manière cohérente et similaire Ces études ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel du CHUV /, et tous les sujets ont donné leur consentement éclairé

Analyses de cytométrie de flux et stimulations de cellules T

En bref, des cellules mononucléaires du sang périphérique cryopréservées ont été décongelées, reposées et stimulées pendant la nuit avec des pools de peptides chevauchants englobant ESAT ou CFP et ensuite étiquetés colorant de viabilité, CD, CD, CD, interféron gamma [IFN-γ], TNF- α, et interleukine [IL-], acquise sur un cytomètre en flux-laser et analysée comme décrit

Analyses statistiques

Le test exact de Fisher a été calculé par test t de Student non apparié en utilisant la version de GraphPad Prism. La régression logistique suivie de la caractéristique de fonctionnement du récepteur L’analyse de la courbe ROC a été utilisée pour évaluer les performances de chaque paramètre. présence de cellules CDT spécifiques à Mtb et la fréquence de lymphocytes CD CD uniques productrices de TNF-α pour identifier la tuberculose active Un modèle de régression logistique linéaire a été utilisé pour évaluer le bénéfice potentiel de la combinaison des deux covariables. Résultats des variables distinctes ont été résumées comme un tableau de contingence donnant sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive PPV, et valeur prédictive négative NPV Ces analyses ont été effectuées en utilisant MedCalc et ont été confirmées en utilisant R-Cran associé au « pROC » et « ROC » forfaits en plus du codage interne

RÉSULTATS

Les réponses des lymphocytes T CD et CD spécifiques de Mtb-Table ont été évaluées en utilisant la cytométrie de flux polychromatique après stimulation avec des pools de peptides ESAT et CFP et marquées avec un marqueur de viabilité et anti-CD, -CD, -CD, -IFN-γ, -TNF-α et -IL- anticorps comme décrit

Profil Fonctionnel Des Réponses De Cellules T De CDb-Spécifiques Et L’identification Des Cellules De CDT Spécifiques Mtb Chez Les Patients Atteints De Tuberculose Active Ou Latent

Conformément à notre observation précédente , le profil de cytokine de la réponse des lymphocytes T CD spécifiques de Mtb était distinct entre les patients tuberculeux actifs et les sujets LTBI, et un P & lt; une proportion plus élevée de lymphocytes T CD uniques produisant du TNF-a a été trouvée chez des patients atteints de tuberculose active.

Figure Vue largeTycobacterium tuberculosis Réponses des lymphocytes T CD et CD spécifiques à Mtb A, Analyse du profil fonctionnel des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb sur la base de l’interféron gamma IFN-γ, de l’IL interleukine et / ou du facteur de nécrose tumorale alpha Production de TNF-α Tous les individus présentaient des réponses T CD spécifiques à Mtb, et les réponses T CD spécifiques à Mtb contre ESAT ou CFP ont été analysées chez des patients atteints de tuberculose tuberculeuse latente et chez des patients atteints de tuberculose TB, respectivement. des différentes fonctions sont montrées sur l’axe des x, et les pourcentages des sous-ensembles de cellules productrices de cytokines distinctes dans les cellules T CD spécifiques à Mtb sont montrés sur l’axe des y Les diagrammes à secteurs résument les données Les comparaisons de la distribution des test t et un test de permutation partielle comme décrit par ailleurs B, Proportion de patients atteints de LTBI et de patients TB avec des réponses de cellules T CD spécifiques détectables par Mtb Des réponses de lymphocytes T CD spécifiques à Mtb ont été définies par la présence de cellules T CDCD-CD productrices d’IFN-y après stimulation par des pools de peptides ESAT et / ou CFP- La signification statistique a été calculée en utilisant le test exact de Fisher en queue C, Magnitude moyenne avec% intervalle de confiance de CDT spécifique à Mtb -réactions cellulaires contre ESAT- et / ou CFP- chez les patients LTBI et TB avec des réponses de lymphocytes T CD spécifiques détectables par Mtb Un test t de Student non apparié a été réaliséFigure View largeTélécharger slideMycobacterium tuberculosis Réponses T CD et CD spécifiques à Mtb A, Analyse du profil fonctionnel des lymphocytes T CD spécifiques de Mtb sur la base de l’interféron gamma IFN-γ, interleukine IL- et / ou du facteur de nécrose tumorale alpha production de TNF-α Tous les individus avaient des réponses T CD spécifiques à Mtb , et les réponses des cellules T CD spécifiques de Mtb contre ESAT ou CFP ont été analysées chez les patients atteints de tuberculose latente LTBI et les patients atteints de tuberculose TB, respectivement Les combinaisons des différentes fonctions sont indiquées sur l’axe des x, et les pourcentages des sous-ensembles de cellules productrices de cytokines distinctes dans les lymphocytes T CD spécifiques à Mtb sont montrés sur l’axe des y Les diagrammes circulaires résument les données Les comparaisons de la distribution des marqueurs ont été réalisées en utilisant le test t de Student et un test de permutation partielle. , Proportion de sujets LTBI et de patients tuberculeux avec des réponses de lymphocytes T CD spécifiques détectables par Mtb Les réponses de lymphocytes T CD spécifiques de Mtb ont été définies par la présence de cellules T CDCD-CD produisant IFN-y après stimulation par ESAT- et / ou Pool de peptides CFP La signification statistique a été calculée en utilisant le test exact de Fisher C, Magnitude moyenne avec% intervalle de confiance des réponses des cellules T CD spécifiques de Mtb contre ESAT- et / ou CFP- chez les patients LTBI et TB avec Mtb-spécifique détectable Réponses des lymphocytes T CD Un test t de Student non apparié a été réalisé. De plus, comme indiqué précédemment , des réponses T CD spécifiques à Mtb ont été détectées chez la majorité des patients tuberculeux actifs% et dans quelques% bjets P & lt; ; Figure B En revanche, l’amplitude des réponses des lymphocytes T CD spécifiques de Mtb, telle que déterminée par la fréquence des lymphocytes T CD productrices d’IFN-y, n’était pas significativement différente entre les LTBI et les sujets tuberculeux actifs Figure C

La puissance des mesures immunologiques individuelles dans le diagnostic de la tuberculose active

Nous avons ensuite calculé la capacité de chaque paramètre, à savoir le profil de cytokine des lymphocytes T CD spécifiques de Mtb ou la détection des réponses lymphocytaires T CD spécifiques de Mtb pour distinguer les patients tuberculeux actifs des sujets LTBI. Sur la base d’une analyse de régression logistique, nous avons confirmé que le profil de cytokine des lymphocytes T CD spécifiques de Mtb était un prédicteur important de la tuberculose active ou de l’aire d’infection latente sous la courbe [AUC] = [% intervalle de confiance {CI}, -]; Figure A En utilisant le seuil prédéfini de% de cellules CD productrices uniques de TNF-a , le rapport de cotes OR était, la spécificité était%, la sensibilité était%, et PPV et NPV étaient% et%, respectivement

Figure View largeTélécharger la diapositive Performances individuelles et combinées des composants distincts de la réponse de lymphocytes T spécifique de Mycobacterium tuberculosis Mtb pour diagnostiquer la tuberculose active TB A, Analyse de régression logistique montrant l’association entre la proportion de facteur de nécrose tumorale alpha alpha CDF-α Cellules T capables de discriminer entre la TB active et l’infection latente de Mtb Zone LTBI sous la courbe [AUC] = [% intervalle de confiance {CI}, -] B, Analyse de régression logistique montrant l’association entre la présence d’un Mtb détectable spécifique Réponse des lymphocytes T CD avec la capacité de discriminer entre TB active et LTBI AUC = [% CI, -] C, analyse de régression logistique montrant l’association entre la combinaison SCORE intégrée de la proportion de lymphocytes T CD uniques productrices de TNF-α et la présence d’une réponse de lymphocytes T CD spécifiques détectables par Mtb avec la capacité de discriminer entre TB active et LTBI AUC = [% CI, -] D, Analysi Performances individuelles et combinées des composantes distinctes de la réponse des lymphocytes T spécifiques à Mtb de Mycobacterium tuberculosis pour le diagnostic de tuberculose active TB A, Analyse de régression logistique montrant l’association entre la proportion de cellules T CD productrices de TNF-α produisant un facteur de nécrose tumorale unique et la capacité à discriminer TB active et infection latente Mtb LTBI sous la courbe [AUC] = [% intervalle de confiance {CI}, – ] B, analyse de régression logistique montrant l’association entre la présence d’une réponse T CD détectable Mtb-spécifique avec la capacité de discriminer TB active et LTBI AUC = [% CI, -] C, analyse de régression logistique montrant l’association entre la combinaison intégrée de SCORE de la proportion de lymphocytes T CD uniques produisant du TNF-α et la présence d’un CD T spécifique à Mtb détectable -cellule réponse avec la capacité de discriminer entre tuberculose active et LTBI AUC = [% CI, -] D, Analyse de la distribution des résultats SCORE sur les sujets LTBI et les patients tuberculeux actifs de cette étudeLa détection des cellules T CD spécifiques de Mtb était également un prédicteur fort de la discrimination entre la tuberculose active et la tuberculose latente, bien qu’il soit moins précis que le profil de cytokine CD T-cellule AUC = [% CI, -]; OR =; spécificité =%; sensibilité =%; PPV =%; VAN =%; Figure B

Combinaison de réponses lymphocytaires T CD et CD spécifiques à Mtb pour diagnostiquer une tuberculose active

Nous avons ensuite combiné les deux composantes de la réponse des lymphocytes T spécifiques à Mtb, soit le profil des cytokines des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb et la détection des réponses des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb. Un modèle de régression logistique a été utilisé pour évaluer la combinaison des deux covariables Ce modèle a estimé les probabilités logarithmiques de probabilité de tuberculose active en fonction des deux variables, en identifiant une nouvelle covariable, appelée « SCORE », qui a été définie comme suit: Log odds = SCORE≈ * [% TNF-α] * [CD] où% TNF-α fait référence au pourcentage de lymphocytes T CD uniques produisant du TNF-α spécifiques à Mtb et CD correspond à zéro ou selon l’absence ou la présence d’une réponse de lymphocyte T CD spécifique à Mtb, respectivement P & lt; pour les deux coefficients avec une ASC de% CI, -; Figure C, le SCORE était une mesure prédictive significativement améliorée de la discrimination entre la tuberculose active et la tuberculose latente par rapport aux deux variables individuelles analysées indépendamment à la fois P & lt; L’analyse de la distribution des résultats de SCORE chez des sujets atteints de tuberculose et de LTBI a montré une différence significative entre les groupes P & lt; ; Figure D Sur la base de l’analyse de régression logistique, un seuil optimal de SCORE de a été déterminé Figure D, et les performances de dosage étaient les suivantes: OR =, spécificité =%, sensibilité =%, PPV =% et VAN =% Comparé à l’utilisation combinée des réponses des cellules T CD et CD a été associée à une amélioration substantielle de l’augmentation en% de la VAN, de l’augmentation en% du VPP, ou de l’augmentation en%, et de la sensibilité% augmentation mais une diminution mineure de la spécificité% D’intérêt, la performance du test n’était pas significativement différente entre la tuberculose culture-positive et la tuberculose culture-négative ou par tuberculose état clinique pulmonaire vs tuberculose extrapulmonaire; Figure supplémentaire, ni par origine géographique des participants

DISCUSSION

Les réponses immunitaires cellulaires sont impliquées dans le contrôle de l’infection Mtb , et les lymphocytes T CD et CD jouent un rôle clé dans la formation de granulomes Contrairement aux lymphocytes T CD, la fonction des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb reste floue. Bien qu’ils aient été décrits chez l’homme et chez des modèles animaux [, -] et associés à la charge pathogène ou à un meilleur contrôle des maladies , les tests basés sur les cellules T comme les tests de libération d’IFN-γ ont sensiblement amélioré le diagnostic. Récemment, le profil fonctionnel des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb s’est avéré être déterminant dans la discrimination entre les patients atteints de tuberculose tuberculeuse et ceux atteints de tuberculose Il a été montré précédemment que Les réponses des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb sont générées en réponse à une charge bacillaire élevée et peuvent être capables de distinguer les enfants atteints de tuberculose active de LTBI Ici, nous démontrons que la détection des réponses des lymphocytes T CD peut discriminer mangé entre la tuberculose active et LTBI également chez les adultes, mais est sensiblement moins puissant que la réponse des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb c.-à-d. cellules T CD productrices de TNF-a Plus important encore, l’analyse multivariée combinant à la fois le profil fonctionnel de CD T cellules et la présence de lymphocytes T CD spécifiques à Mtb ont conduit à l’identification d’une nouvelle variable SCORE et à une discrimination significativement améliorée entre les patients atteints de tuberculose active vs latente.Les mesures immunologiques, c’est-à-dire l’augmentation du pourcentage de TNF unique Les cellules T CD productrices de α et la détection de lymphocytes T CD spécifiques de Mtb, lorsqu’elles sont utilisées en combinaison, ont une sensibilité% et une spécificité% dans la même gamme d’autres dosages immunologiques ne mesurant que l’IFN-γ tels que le TSPOTTB et le QuantiFERON- Le test TB Gold In-Tube est largement supérieur au test cutané à la tuberculine Cependant, le test basé sur la cytométrie en flux présente l’avantage de discriminer entre le tuberculosis actif et latent. s, ce qui n’est pas le cas pour les tests mesurant uniquement les lymphocytes T spécifiques à Mtb produisant de l’IFN-γ. A cet égard, des études récentes ont identifié d’autres marqueurs immunologiques pouvant discriminer entre tuberculose active et latente. Les nouveaux marqueurs incluent IFN-γ et IL- réponses uniques des lymphocytes T et diminution de l’expression des CD dans les lymphocytes T CD spécifiques à Mtb Cependant, les marqueurs antérieurs ont été analysés dans un très petit nombre & lt; Il a été démontré que ce dernier différencie la tuberculose active de la tuberculose chronique uniquement chez les patients pédiatriques et est associé à une tuberculose active persistante chez les patients adultes . Par conséquent, le dosage cytométrique en flux et l’utilisation combinée Les mesures décrites dans la présente étude représentent l’outil le plus instrumental pour discriminer la tuberculose active et la tuberculose latente chez les patients adultes. La sensibilité des tests immunologiques pour discriminer la tuberculose active et la tuberculose latente est inférieure à celle des tests moléculaires tels que le test Xpert MTB / RIF, qui est basé sur l’amplification de l’ADN et a une sensibilité de% dans les cas à bacilloscopie positive et culture positive et% dans les cas à bacilloscopie négative et culture positive. Cependant, la limite de ce test est qu’il ne peut être effectué que sur des échantillons d’expectorations, difficiles à collecter chez les enfants. En ce qui concerne la faisabilité de la mise en œuvre de cette technologie Dans les pays où la prévalence de la tuberculose est élevée, le panel d’anticorps pour mesurer ces réponses lymphocytaires T CD et CD spécifiques à Mtb a été validé dans notre laboratoire pour diagnostic et systématiquement réalisé sur un cytomètre de flux Facscanto au CHU de Lausanne. Cependant, le test est actuellement effectué sur des préparations de cellules mononucléées sanguines, et la possibilité d’effectuer le dosage sur le sang total facilitera considérablement la mise en œuvre du test dans les laboratoires de En conclusion, le présent dosage basé sur la cytométrie en flux et la combinaison de mesures immunologiques – les lymphocytes T CD spécifiques de Mtb produisant le TNF-α et la détection des réponses des lymphocytes T CD spécifiques à Mtb – représentent un outil diagnostique puissant pour discriminer entre actifs. la tuberculose et l’infection latente

Remarques

Remerciements Les auteurs remercient Delphine Gani pour sa coordination logistique Les auteurs remercient également de nombreux autres membres des équipes du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois et de l’Initiative Sud-Africaine de Vaccins Tuberculeux qui ont aidé à l’inscription et à l’évaluation des participants et finalement aux participants eux-mêmes. Les résultats ont été financés par l’Institut suisse de recherche sur les vaccins et le septième programme-cadre de la Communauté européenne FP / – et FP / – sous le numéro de l’accord de subvention de la Commission européenne. Méthodes pour différencier les états pathologiques de l’infection à Mycobacterium tuberculosis « Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent comme pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués |

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