La colonisation par pneumocystis est hautement prévalente chez les poumons autopsiés de la population générale

Contexte L’augmentation de l’ADN Pneumocystis dans les prélèvements respiratoires non invasifs d’adultes asymptomatiques immunocompétents et le tropisme pulmonaire caractéristique de Pneumocystis suggèrent que des infections pulmonaires asymptomatiques avec Pneumocystis surviennent après une infection primaire. Cependant, les études de pneumocystose dans les poumons autopsiés d’adultes immunocompétents sains n’ont pas SuccessMethods Les poumons de personnes décédées de violentes causes d’accidents, d’homicides et de suicides et de maladies non-violentes causant une mort rapide dans la rue à Santiago du Chili – pour lesquelles une autopsie était légalement requise – ont été examinés pour pneumocystose par PCR en chaîne. Amplification de l’ADN de la grande sous-unité mitochondriale ARN ribosomique P jirovecii gène spécifique et analyse microscopique immunofluorescente Les méthodes de concentration tissulaire pulmonaire et l’analyse de ~% du poids du lobe supérieur droit RUL ont été nécessaires pour atteindre le seuil de sensibilité des dosages. Étiqueté pour être P jirovecii négatif après l’analyse de% du poids RUL dans le groupe de mort violente ont été confirmés négatifs en analysant le tissu supplémentaire, totalisant% -% du poids RUL P jirovecii a été identifié par PCR nichée en% des individus [% ] dans le groupe de la mort violente et [%] dans le groupe de la mort non-violente; P & gt; et en outre par l’analyse microscopique dans tous les individus qui ont été testés positifs pour l’ADN de P jirovecii dans le groupe de mort violente Analyse de tissu au-delà de% du poids RUL pour les personnes qui ont testé négatifs ont donné des résultats systématiquement négatifs. La moitié de la population adulte générale Nos résultats renforcent le concept selon lequel les adultes immunocompétents développent fréquemment des réinfections auto-limitées tout au long de la vie et participent à la circulation de P jirovecii comme réservoir infectieux pour les individus sensibles

Le développement de techniques moléculaires diagnostiques hautement sensibles pour l’amplification de l’ADN, telles que la PCR en chaîne, a permis de détecter les micro-organismes pneumocystis chez des hôtes immunocompétents qui ne seraient pas détectés par les techniques utilisées pour le diagnostic de pneumocystose chez les patients immunodéprimés. Cette technique d’amplification d’ADN par PCR nichée hautement sensible est utilisée dans des études épidémiologiques pour détecter l’ADN de Pneumocystis dans des échantillons respiratoires non invasifs tels que des prélèvements nasaux, des lavages oropharyngés, des prélèvements rhinopharyngés, des expectorations, etc. différentes populations d’individus immunodéprimés et immunocompétents sans PCP manifeste, une affection appelée colonisation, état de porteur, et infection subclinique Cependant, malgré le tropisme pulmonaire inhérent de Pneumocystis et la corrélation entre le nombre de Pneumocystis organi sms récupérés à partir de spécimens non invasifs versus pulmonaires montrés dans des modèles animaux immunodéprimés de PCP qui développent une charge typiquement élevée de Pneumocystis dans les poumons , les résultats d’amplification d’ADN PCR nichée dans des échantillons respiratoires non invasifs provenant d’individus immunocompétents n’ont pas été démontrés prédire l’atteinte pulmonaire Des études d’autopsie pulmonaire sont donc nécessaires pour caractériser l’incidence réelle de la colonisation pulmonaire et permettre une meilleure compréhension de l’épidémiologie, de l’histoire naturelle et du pouvoir pathogène éventuel de l’infection à P. jirovecii dans la population générale. les adultes immunocompétents sains varient de% dans les études d’expectorations induites ou expectorées et les écouvillons nasaux à% dans une étude utilisant des échantillons de lavage oropharyngés des travailleurs administratifs hospitaliers Nevez et al ont rapporté une incidence% dans les échantillons de lavage broncho-alvéolaire invasif de l’immunodéficience humaine cy virus les individus séronégatifs De même, l’ADN de P jirovecii a été documenté en% des échantillons d’expectoration et en% des échantillons de biopsie pulmonaire dans différentes études de patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive En outre, les travailleurs immunocompétents développent une En outre, les rongeurs adultes immunocompétents développent une infection auto-limitée légère, comme documentée par l’analyse microscopique et PCR nichée, dans les poumons après exposition à une source infectieuse Ces données suggèrent que les réinfections avec Pneumocystis surviennent après l’infection primaire chez les individus sains et donc que P jirovecii peut être commun dans les poumons des adultes immunocompétents Cependant, les efforts pour identifier Pneumocystis dans les spécimens de tissus pulmonaires de la population adulte générale n’ont pas été couronnés de succès Contrairement à l’incidence signalée chez les adultes immunocompétents, celle déclarée parmi les soins vos nourrissons sont remarquablement élevés, comme cela a été documenté en utilisant à la fois des échantillons non invasifs et pulmonaires variant de% à% dans le premier et de% à% dans le second. Examen des échantillons de tissu pulmonaire par enfant À l’instar des organismes qui peuvent être cultivés en culture, le type, la qualité, la quantité et le nombre d’échantillons examinés – ainsi que la technique de traitement – sont critiques pour la détection de charges pneumocystes minimes. Les hôtes, chez qui Pneumocystis se réplique en faible nombre et tend à se regrouper Les variations dans les techniques de traitement et dans le type et la quantité de spécimens respiratoires analysés peuvent expliquer les différences d’incidence de colonisation signalées, et cette possibilité nous a incité à retester l’hypothèse de Pneumocystis poumons d’adultes en bonne santé en augmentant la quantité de tissu pulmonaire examiné pour les adultes en proportion de la quantité de tissu pulmonaire exa pour les nourrissons dans des analyses de PCR et d’immunofluorescence nichées, sous l’hypothèse secondaire simple que l’analyse de plus de tissu pulmonaire avec des techniques de concentration est nécessaire pour atteindre le seuil de sensibilité des tests utilisés et prouver le conceptLes autopsies sont rarement effectuées pour les personnes qui meurent naturellement à la maison. , nous avons recherché des personnes décédées de causes violentes d’accidents, d’homicides et de suicides ou de maladies non-violentes provoquant une disparition rapide dans la rue, dont les autopsies sont légalement requises au Chili. Les personnes admises à l’hôpital avant leur décès ont été exclues. le biais potentiel de l’environnement hospitalier dans les taux de colonisation

Méthodes

Éthique La commission d’éthique de la zone métropolitaine de santé de Santiago a approuvé cette étude. La loi chilienne exige des autopsies pour les décès accidentels. Échantillons de spécimens et collecte de données Entre mai et novembre, des prélèvements pulmonaires ont été obtenus autopsiés par des personnes décédées sans hospitalisation. L’autopsie était légalement obligatoire au bureau du coroner chilien du Service médico-légal de Santiago. Les sujets ont été sélectionnés pour n’avoir pas été admis à l’hôpital, mort inattendue ou violente dans la rue, absence de troubles immunocompromisants connus et absence de maladie pulmonaire évidente. Les informations médicales, y compris l’âge, la date du décès, les conclusions de l’autopsie et les diagnostics d’autopsie, ont été recueillies à partir du rapport du coroner avant les analyses de Pneumocystis. Le poumon droit a été retiré à l’aide d’un équipement stérile, placé dans un sac en plastique stérile et stocké à – ° C jusqu’au traitement pour analyse. Seul le poumon a été traité un jour. Le poumon a été lentement décongelé. Une fois partiellement décongelé, le poumon a été transporté dans une enceinte de biosécurité, retiré du sac, placé sur une grande plaque stérile, trempé et nettoyé avec du sérum physiologique tamponné au phosphate stérile PBS pH et déplacé vers une nouvelle plaque stérile, sur laquelle les lobes ont été séparés Le lobe supérieur droit RUL a été sélectionné dans tous les cas Le poids a été enregistré, et la plèvre a été soigneusement enlevée en utilisant un nouvel équipement stérile. du poids de RUL ont été obtenus à partir de tissu pulmonaire profond à travers différentes incisions -cm-profondes dans la surface décortiquée Chaque spécimen a été obtenu en utilisant un équipement stérile séparé et a été traité individuellementPneumocystisDNA extracti On a découpé les spec-imens en petits morceaux et on les a homogénéisés par agitation par agitateur magnétique en mL de PBS stérile pH dans des flacons à bouchon à vis recouverts de glace. L’homogénat a ensuite été filtré en utilisant une gaze stérile; les flacons d’agitation ont été lavés avec du PBS stérile pour recueillir les restes des échantillons; la centrifugation a été effectuée à ° C pendant min à g; le surnageant a été jeté; et le culot a été reconstitué en μL de pH PBS stérile et stocké à-° C jusqu’à ce que l’ADN de traitement soit extrait et purifié de μL de cette solution, en utilisant le kit QIAamp DNA Mini Qiagen comme décrit ailleurs Le tissu hépatique a été traité de la même manière L’ADN de Pneumocystis a été identifié par une procédure de PCR nichée en utilisant les amorces oligonucléotidiques pAZ-E et pAZ-H qui ont été conçues pour le gène codant l’ARN ribosomique de la grande sous-unité mitochondriale [ ARNr] de Pneumocystis et qui amplifient toutes les espèces de Pneumocystis et les amorces internes pAZ-X et pAZ-Y qui sont spécifiques de P jirovecii, comme décrit ailleurs Les expériences de PCR ont été réalisées dans une pièce séparée dans des capots stériles. -des contrôles internes négatifs et humains de la β-globine ont été inclus avec chaque échantillon, afin de surveiller la contamination croisée et les inhibiteurs de l’ADN Nettoyage standard et stérili Les procédures de zation ont été suivies pour les matériaux réutilisables, y compris une immersion en dilution en% d’ammoniac superquaternaire et stérilisation par chaleur humide ou sèche, le cas échéant avant et après lavage dans une solution neuve d’Extran Merck Standard procédures de nettoyage et de stérilisation utilisant des ADN DNA Away; Les produits scientifiques de VWR ont été appliqués à l’armoire de biosécurité et les unités de capot entre les échantillons de traitement de chaque sujet ont été considérés comme pneumocystis positifs lorsque la bande attendue de l’ADN de P jirovecii a été visualisée dans ou plus de ses échantillons pulmonaires. être Pneumocystis négatif si aucun ADN de P jirovecii n’a été documenté. Analyse microscopique Des formes de Pneumocystis ont été étudiées par analyse microscopique en utilisant une coloration immunofluorescente du kit MeriFluor; Meridian Biosciences dans des aliquotes concentrés de spécimens homogénéisés provenant d’individus décédés de causes violentes Les observateurs de la microscopie CAP, RB et SLV ne connaissaient pas les résultats de la PCR nichée Un sujet était considéré comme Pneumocystis positif quand ou plus de kystes typiques ou & gt; Les résultats ont été approuvés par tous les observateurs CAP, RB et SLVAnalyse statistique L’ensemble statistique Stata, version StataCorp, a été utilisé pour déterminer si le transport de Pneumocystis était associé à des circonstances de décès, par une table de test exacte de Fisher. Différences pour lesquelles P & lt; ont été considérés comme significatifs

Vue de la table largeTéléchargement des résultats de slideAutopsy et Pneumocystis, tel que déterminé par Polymerase amplification de la chaîne d’amplification de l’ADN et, en outre, par analyse immunofluorescente pour ceux qui sont morts d’une CauseTable violente Voir grandDownload slideAutopsy Résultats et état Pneumocystis, tel que déterminé par Polymerase Chain Reaction DNA Amplification et, en outre, par analyse immunofluorescente pour ceux qui sont morts d’une cause violente

Résultats

Caractéristiques du sujet et spécimens d’autopsie Les poumons droits complets ont été obtenus à partir des individus des mâles et des femelles. Leur âge médian à la mort était de plusieurs années; moyenne, les années et les individus étaient & lt; années d’âge, – années; Les causes de décès sont les suivantes: accidents de la route; suicide, homicides, choc électrique, ; noyade, ; causes médicales,; et indéterminé, les diagnostics d’autopsie pour les causes médicales étaient les suivants: infarctus du myocarde,; tamponnade cardiaque, ; accident vasculaire cérébral, ; hémorragie sous-arachnoïdienne; hémorragie digestive, péritonite, et l’obstruction intestinale. Le temps médian estimé entre la mort et l’autopsie était de h, h; La pneumonie a été exclue par une analyse microscopique chez tous les sujets. Les antécédents d’utilisation de médicaments ayant une activité anti-Pneumocystis ou d’exposition à des immunodéprimés n’étaient pas disponibles. Chaque échantillon de tissu a été analysé individuellement. g; la moyenne, g, et le poids total médian des spécimens analysés était de g, g; Les résultats des réactions d’amplification des témoins de contamination de l’extraction de l’ADN et de la purification à l’aide du tissu hépatique étaient négatifs à toutes les occasions. La PCR en une seule étape a montré des résultats négatifs pour Pneumocystis. ADN dans tous les échantillons L’ADN de P jirovecii a été détecté par PCR nichée chez 100% des sujets, en% des sujets masculins et chez% des sujets féminins. Un patient a donné des bandes d’ADN qui étaient très difficiles à voir des échantillons, et l’analyse d’un pourcentage supplémentaire de poids RUL démontré clairement des bandes positives dans de nouveaux spécimens de tissus Pjirovecii ADN négatif des individus dans le groupe de la mort violente ont été retestés en utilisant des échantillons avec un% de poids RUL supplémentaire, et les résultats ont été constamment fréquemment chez les personnes ayant un problème médical comme le diagnostic d’autopsie% que dans ceux dy dans les accidents de la circulation%, de% de suicides, ou d’homicides% Le nombre médian de spécimens analysés par sujet était la gamme, – spécimens; moyenne, spécimens La proportion médiane d’échantillons ADN-positifs par sujet était de% range,% -%; moyenne,% Tous les échantillons étaient positifs pour les individus; leurs causes de décès étaient les accidents de la circulation n =, le suicide n = et l’infarctus du myocarde n = Parmi les personnes décédées de causes violentes, l’ADN de P jirovecii était plus fréquent chez et & gt; ans que dans les autres groupes d’âge Figure

Figure Pneumocystis jirovecii L’ADN de Pneumocystis jirovecii a été testé par amplification en chaîne par polymérase nichée et par immunofluorescence dans de multiples échantillons pulmonaires; La pneumonie à pneumocystis jirovecii a été testée par amplification en chaîne par polymérase nichée. L’amplification de l’ADN et l’analyse par immunofluorescence ont permis de tester l’ADN de Pneumocystis jirovecii chez des individus décédés de causes violentes à Santiago, au Chili. dans plusieurs échantillons pulmonaires; Le diagnostic était cohérent avec les deux méthodesAnalyses microscopiques Les patients décédés de causes violentes ont été analysés par microscopie immunofluorescente en plus de la PCR nichée. Chaque échantillon a été analysé séparément et la lecture microscopique a été prise par patient. Les formes de Pneumocystis, peu nombreuses, ont été visualisées. par immunofluorescence chez tous les individus qui ont été testés positifs et chez aucun de ceux testés négatifs pour l’ADN de P jirovecii par PCR nichée et Figures et Cependant, la PCR nichée, en accord avec sa plus grande sensibilité, a identifié un plus grand nombre d’échantillons positifs immunofluorescence – c’est-à-dire que le nombre médian d’échantillons positifs était par plage de patients, -; moyenne, par PCR nichée et par gamme de patients, -; signifie, par immunofluorescence

Discussion

et plus récemment avec les résultats de l’étude de Medrano et al , qui ont documenté l’obtention de prélèvements de lavage oropharyngiens P jirovecii négatifs en mois d’intervalle en% d’individus précédemment positifs. La proportion d’individus Pneumocystis-négatifs dans la présente étude suggère également les résultats de Pneumocystis dans cette population reflètent vraisemblablement les réinfections pulmonaires qui surviennent après l’infection primaire et que les réinfections sont fréquentes chez les personnes immunocompétentes. Des données pour soutenir le concept de réinfection sont disponibles chez des patients immunodéprimés Par exemple, différents génotypes Pneumocystis ont été documentés chez des les patients qui connaissent des épisodes de pneumonie survenant & gt; De plus, une étude épidémiologique approfondie a montré que les génotypes de P jirovecii dans le PCP lié au SIDA sont plus étroitement liés au lieu de résidence qu’au lieu de naissance P jirovecii identifiés dans cette étude n’ont pas été génotypés. des patients immunodéprimés mourant de PCP ont démontré une variation des génotypes de P jirovecii entre les différents lobes pulmonaires, indiquant que leur origine pourrait ne pas être nécessairement clonale Ainsi, il est possible que différents clones de P jirovecii dans les lobes autres que La quantité rare d’organismes Pneumocystis trouvés dans les poumons des individus dans cette étude reflète peut-être l’efficacité de leurs réponses immunitaires dans le nettoyage de l’organisme. Cependant, cette charge minimale de Pneumocystis peut également être interprétée comme étant latente Pjirovecii organismes sous la vue traditionnelle de la réactivation de la latence, moins prévalente Preuve documentant différents P jirovecii gen otypes dans différents épisodes de PCP, rapports de groupes de PCP dans les quartiers de patients immunodéprimés suggérant la transmission, et des preuves supplémentaires de modèles animaux montrant la transmission de l’air, la clairance de Pneumocystis après PCP ou infection primaire, et le manque de réactivation PCP En revanche, dans les analyses d’immunofluorescence actuelles, des souris de différentes tailles ont été colorées et compatibles avec des formes de kystes et de trofozoïtes, suggérant une réplication active. La répartition selon l’âge chez les personnes positives à Pneumocystis ayant connu une mort violente – avec des pourcentages plus élevés avant et après l’âge – peut s’expliquer par le fait que les réinfections successives sont plus fréquentes chez les patients immunocompétents. fréquent avant l’âge de pour une raison inconnue Par conséquent, le Pneumocystis trouvé dans cette étude est compatible avec le concept de plus en plus reconnu de la colonisation, du portage ou de l’infection asymptomatique . La signification clinique de cette infection bénigne chez l’hôte immunocompétent est activement étudiée Christensen et al ont récemment documenté qu’une infection à Pneumocystis chez des souris immunocompétentes induit une aggravation de la fonction pulmonaire et des altérations histologiques compatibles avec l’emphysème en cas d’exposition à la fumée de tabac. entre la colonisation par P jirovecii et la sévérité de la BPCO soulève la possibilité que Pneumocystis soit impliqué dans la pathogenèse de cette pathologie Des lymphocytes périphériques plus élevés avec des réponses lymphocytaires T CD accrues ont été rapportés chez des sujets atteints de bronchite chronique et une réponse inflammatoire systémique levé sérique els facteurs de nécrose tumorale α, interleukine et interleukine ont été documentés chez des patients atteints de BPCO et de pneumocystose On ne peut pas conclure que Pneumocystis a pu être détecté dans des échantillons non invasifs de cette population, car des échantillons non invasifs n’ont pas été obtenus. Ces méthodes d’échantillonnage doivent être validées chez les personnes immunocompétentes. Ce travail fournit des preuves directes que les infections pulmonaires légères avec les organismes Pneumocystis sont très répandues chez les personnes immunocompétentes, en particulier chez les adultes. Les pneumocystes des poumons humains adultes sont très faibles et se situent en dessous du seuil de sensibilité de l’ADN amplifié par PCR. procédure de diagnostic Par conséquent, l’analyse de grandes quantités de tissus avec des techniques de concentration comme décrit ci-dessus est nécessaire pour le diagnostic Des études supplémentaires pour déterminer si ces réinfections légères Pneumocystis chez les adultes en bonne santé sont d’importance clinique sont justifiées

Remerciements

Soutien financier Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico FONDECYT, Santiago, Chili Subvention de recherche à SLVPotentiel de conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits

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