Endocardite polyclonale staphylococcique causée par la variabilité génétique

Les cultures de sang obtenues chez un patient porteur d’une endocardite à valve prénatale Staphylococcus epidermidis ont donné des souches de macrorestriction du S epidermidis Genome et des analyses de polymorphisme de longueur fragmentée amplifiées de ces souches ont montré qu’elles appartenaient à des clones différents, très proches, suggérant qu’elles résultaient de gènes génétiques. Variabilité d’une souche infectante pendant l’épisode infectieux Les expériences in vivo dans un modèle d’infection à corps étranger utilisant des souches de S epidermidis chez le rat ont montré une variabilité génétique similaire à celle de la souche infectante. Dans le modèle rat, nous avons également détecté la présence simultanée de différents clones qui étaient identiques à ceux isolés de notre patient, confirmant ainsi la possibilité de variabilité génétique Il est important de noter que les clones isolés de notre patient présentaient des antibiogrammes différents Par conséquent, dans les cas d’infections liées à des dispositifs étrangers dus à la coagulase- staphylocoques négatifs, le pos La possibilité d’une infection polyclonale doit être prise en compte, en particulier en ce qui concerne les différences de sensibilité aux antibiotiques

Les staphylocoques à coagulase négative sont la cause la plus fréquente de bactériémie liée à un dispositif étranger, en général, et l’endocardite à valve prothétique, en particulier . Cependant, l’interprétation clinique des hémocultures positives pour les staphylocoques à coagulase négative n’est pas facile. distinction entre les organismes infectieux et les contaminants non-infectieux de la flore cutanée En plus d’une variété d’autres critères , une distinction communément admise entre l’infection et la contamination est que les véritables infections staphylococciques coagulase-négatives, et l’endocardite en particulier, sont monoclonales. la parenté génétique des organismes isolés pourrait donc fournir une indication sur la signification clinique de la bactériémie due aux staphylocoques à coagulase négative. Seuls quelques chercheurs ont en effet examiné la parenté génétique des staphylocoques à coagulase négative dans les bactériémies associées aux dispositifs étrangers , mais leurs conclusions soutiennent tous le monoclo nalité de ces infections.Dans de récents rapports, cependant, il a été montré que l’endocardite prothétique ou la bactériémie liée au cathéter peuvent être polyclonales, probablement à la suite de multiples clones qui colonisent simultanément les corps étrangers Un autre chercheur suggère une variation phénotypique et génotypique parmi les souches de Staphylococcus epidermidis infectées par des prothèses articulaires infectées Si plusieurs clones peuvent coloniser simultanément des dispositifs étrangers, cela pourrait avoir des conséquences importantes, à la fois sur la façon dont les tests de sensibilité sont effectués et sur l’interprétation. Il n’existe cependant pas de données sur l’incidence de la polyclonalité dans l’endocardite causée par les staphylocoques à coagulase négative. Dans le cadre d’une étude en cours sur la bactériémie causée par les staphylocoques à coagulase négative, nous avons régulièrement recueilli de multiples staphylocoques à coagulase négative. colonies de patients bactériémiques Nous décrivons ici la présence de multiples clones de staphylocoques à coagulase négative chez un patient porteur de valvules cardiaques prothétiques, probablement dû à la variabilité génétique de la souche infectante.

Matériaux et méthodes

Analyses phénotypiques Pour chaque flacon de culture sanguine positive, les colonies ont été prélevées de la plaque de gélose au sang originale. Toutes les colonies ont été cultivées pendant une nuit dans un bouillon BHI infusion cœur-cœur et congelées jusqu’à analyse. sur la base de la présence de coagulase, de phosphatase, d’uréase; sensibilité à la polymyxine B et à la novobiocine; et le métabolisme de l’esculine, du saccharose, du mannose, du maltose, du tréhalose, du mannitol, du lactose et des désoxyferroxamine Les tests de sensibilité ont été réalisés en utilisant une méthode de dilution en gélose sur gélose Mueller-Hinton selon les recommandations du National Committee for Clinical Laboratory Standards. ont été isolés comme décrit et digérés avec U EcoRI La séparation des fragments résultants a été réalisée par électrophorèse sur un gel d’agarose% wt / vol pour la détection par PCR du gène aacA-aphD a été isolée par lyse rapide d’une seule colonie comme décrit ailleurs [ ] Une amplification a été réalisée avec μM d’amorces décrites par Vanhoof et al dans un volume total de μL contenant μM de chaque désoxynucléoside triphosphate, mM MgCl, U de polymérase AmpliTaq Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA et μL de lysat bactérien A Un cycle unique de min à ° C a été suivi par des cycles de min à ° C, min à ° C, et min à ° C Après amplification, μL de produit PCR a été chargé sur un aga de% wt / vol gel rose L’isolement de l’ADN génomique total et la macrorestriction de l’ADN génomique avec U de SmaI et SstII a été réalisée comme décrit ailleurs Les fragments de restriction ont été séparés sur des champs électriques homogènes serrés CHEF Mapper système Bio-Rad, Hercules, CA vol agarose gel Bio-Rad et V pulsations alternées à un angle ° en gradient de temps-a pour le premier h et pour l’ADN génomique de gradient de temps-impulsion h suivant a-s de la souche NTCC de Staphylococcus aureus, coupé avec SmaI La digestion génomique de l’ADN a été réalisée avec U de HindIII et TaqI. Des adaptateurs de site de restriction appropriés -CTCGTAGACTGCGTACC et -GACGATGAGTCC-TGAC ont été ajoutés à une finale. la concentration de et nM, respectivement, et l’amplification sélective a été faite avec les amorces ‘-GACTGCGTACCAGCTTA et’ -GATGAGTCCTGACC-GAAT pour calculer la parenté génétique des souches, nous comparons En utilisant le logiciel Gel Compar Applied Maths, Kortrijk, Belgique Expériences in vivo Le modèle de l’infection par le corps étranger chez le rat utilisé dans nos expériences était essentiellement tel que décrit précédemment . Des rats Fisher libres Rega Institute, Leuven, Belgique ont été conventionalisés par exposition à des rats Fisher normaux pendant des semaines et ont permis de se reproduire. Dans nos expériences, nous avons utilisé la prochaine génération de rats, nés et élevés dans des conditions animales conventionnelles. et anesthésiés avec de l’éther diéthylique pendant la durée de la procédure. Trois cathéters ont été implantés par voie sous-cutanée chez chaque animal dans des conditions aseptiques. Des cathéters ont été inoculés avec du cfu de S epidermidis juste avant l’implantation. , après centrifugation, remis en suspension dans une solution saline et dilué à la concentration appropriée dans le bouillon BHI Les cathéters ont été immergés dans la suspension bactérienne pour h à ° C Trois cathéters n’ont pas été implantés chez les rats mais immédiatement plaqués sur gélose Mueller-Hinton et incubés pour h à ° C afin de déterminer la taille de l’inoculum sur les cathéters. ont été explantés, soumis à un vortex à s, soniqué à, Hz dans un bain d’eau pour min. Branson Ultrasonics, Danbury, CT et encore tourbillonné pour s Le sonicat a été étalé sur la gélose Mueller-Hinton avec un Spiral Plater Modèle B Spiral Systems, Cincinnati, OH selon les directives du fabricant Après incubation pour h à ° C, les plaques ont été comptées avec le modèle de compteurs de colonies de bactéries. Spiral Systems

Résultats

Les analyses du génome des souches de culture hémisphérique ont été réalisées par macrorestriction et analyse AFLP de l’ADN génomique total. Avec l’analyse de macrorestriction SmaI, des profils de bandes distincts ont été trouvés. Chaque motif SmaI inclus ou des fragments parmi les aminoglycosides. On a identifié des souches sensibles, des profils de bandes distincts, qui différaient par la position d’une seule bande de ~ kb. Ces souches ont été appelées souches S dans des bouteilles et souches S dans des bouteilles Parmi les souches résistantes aux aminoglycosides, on a trouvé des souches dans des bouteilles et des souches R dans une bouteille Le motif de bandes R différait par une bande supplémentaire de kb du motif de bandes S de type sensible; le type de bande R différait par la même bande supplémentaire de l’autre type S sensible Les types résistants R et R différaient l’un de l’autre dans la position de la même bande kb unique trouvée pour les types S et S Avec l’utilisation de SmaI analyse de macro-restriction, les coefficients de similarité de Dice entre les profils de bandes S, R, S et R étaient compris entre% et% Avec l’utilisation de la macrorestriction SstII, chaque motif inclus ou fragments figure Le motif S de bandes sensibles aux aminoglycosides différait dans la position d’une seule bande de ~ kb du motif de type S Les patrons de baguage R et R différaient également les uns des autres par la position de cette même bande Les types R et R différaient respectivement des motifs S et S par la perte d’un seul – bande kb Avec l’utilisation de l’analyse de macrorestriction SstII, les coefficients de similarité de Dice entre les profils de bandes S, R, S et R étaient compris entre% et% Analyses supplémentaires de la teneur en plasmides coupés EcoRI de tous les aminoglycosides- Des analyses de macrorestriction des souches de l’épisode précédent d’endocardite en décembre ont montré que toutes avaient des profils de bandes identiques et n’étaient manifestement pas étroitement liées aux souches du deuxième épisode actuel de mars Coefficient de dés avec le type S,% Afin de confirmer les données de macrorestriction, nous avons également analysé la parenté génétique des souches avec une autre technique génétique, dans ce cas AFLP Nous avons trouvé une seule différence de bande entre les profils de type et de souches ainsi que pour les aminoglycosides sensibles. Dans les deux cas, les souches résistantes aux aminoglycosides présentaient des profils de bandes de type R et R avec des bandes plus grandes que celles de leurs souches respectives de type S et S sensibles aux aminoglycosides. Ceci a donné dans les deux cas un coefficient de dés de% Les différents fragments générés par la macrorestriction SmaI du génome des différentes strai ns ont été isolés séparément du gel, et l’ADN extrait a été soumis à une PCR avec des amorces spécifiques aacA-aphD Après PCR, des amplicons de la bonne taille bp indiquant la présence du gène codant pour l’enzyme AAC’APH « ont été trouvés seulement pour souches avec des profils de bandes R et R et seulement pour l’ADN extrait des fragments supplémentaires qui n’étaient pas présents dans les souches S et S. Ceci montre clairement que les bandes supplémentaires dans les souches R et R résultent de la présence du gène codant l’enzyme AAC’APH « Examen in vitro et in vivo de la variabilité génétique Une souche avec le motif de bandes R a été sous-cultivée in vitro dans du bouillon BHI Dix cultures différentes de cette même souche ont été repiquées tous les jours pendant des mois, et les cultures ont été repiquées tous les jours. mois Après mois et à la fin des mois, les cultures ont été étalées sur gélose trypticase-soja, et les colonies de chaque plaque ont été choisies et examinées. Nous avons trouvé que toutes les souches ont conservé leur phénotype original et leur électrophorèse sur gel en champ pulsé.Pour tester la variabilité génétique in vivo, des cathéters inoculés avec une souche appartenant au type de bande R ont été implantés chez chacun des rats. Une infection associée au corps étranger s’est développée dans tous les cathéters, et après jours, les cathéters ont été explantés. Les bactéries adhérentes ont été retirées par sonication et plaquées sur des plaques de gélose trypticase-soja. Cinq colonies ont été prélevées de chaque plaque et examinées. Nous avons trouvé que les souches examinées présentaient des caractéristiques phénotypiques et / ou de bandes différentes. de celles de la souche originale infectante R et du tableau Sept souches avaient des profils de bandes identiques au type S. Ces souches étaient toutes sensibles aux aminoglycosides et avaient toutes perdu le gène codant pour l’enzyme AAC’APH « Nous avons également détecté une souche avec un nouvelle bande qui différait du type R par la perte d’une seule bande dans la gamme -kb, mais sans changements phénotypiques apparents En outre, nous avons remarqué l’émergence de souches avec un type R et avec un type S qui avait changé de résistance aux macrolides / clindamycines à la susceptibilité sans modifications génétiques détectables supplémentaires

Discussion

Lones a été proposé La parenté génétique Le coefficient de dés entre les différents clones isolés de ce patient était>% Il est peu probable que, suite à une contamination aléatoire au cours de la ponction veineuse, plusieurs clones génétiquement étroitement apparentés à un seul clone infectieux. aurait pu être inoculé Une étude a montré que la coexistence dans la flore cutanée de colonies de S epidermidis génétiquement proches qui se distinguaient par la morphologie et la pharmacorésistance était rare. Études qui ont utilisé la macrorestriction du génome pour examiner la parenté génétique de différentes souches de S epidermidis dans le sang ont généralement trouvé une différence de plusieurs bandes entre ces souches [,, données non publiées des auteurs] Il est admis que chez les patients infectés par un seul clone, la mutation, le réarrangement, la perte ou la à une diversité de phénotypes Changements phénotypiques de pharmacorésistance, s’ils ne sont pas associés à la macrorestriction p Mickelsen et al ont décrit les changements dans la sensibilité aux antibiotiques durant une infection. Ils ont rapporté des changements dans le profil de sensibilité aux antibiotiques chez les patients infectés par une souche épidémique commune de S épidermidis. Ces changements de sensibilité aux antibiotiques étaient apparemment liés à Des modifications du contenu en plasmidesHedin et Goering ont rapporté de légères modifications similaires du fragment de macrorestriction du génome avec le temps chez les staphylocoques coagulase-négatifs provenant d’un seul patient La variabilité du génome des staphylocoques coagulase-négatifs dus aux bactériophages a été documentée par Lina et al. ont montré que des variations mineures dans les profils de restriction PFGE entre les souches de staphylocoques coagulase négative pourraient être causées par l’intégration des phages dans les souches de notre patient, les types de bandes de PFGE R et S et R et S diffèrent par une bande unique. un seul événement génétique – le plus probable l’acquisition ou la perte de Le gène aacA-aphD Ce gène est connu pour être localisé sur un transposon ou un plasmide Des changements dans la teneur en plasmide n’ont pas pu être démontrés entre les clones sensibles et résistants, suggérant que le transfert plasmidique n’était pas la cause du changement observé dans la susceptibilité aux antibiotiques Soit la perte ou l’acquisition d’un gène de résistance chromosomique pourrait être l’événement génétique conduisant à la variabilité génétique observée. Ceci est soutenu par la présence du gène aacA-aphD dans la bande unique qui distingue les clones résistants et sensibles. Thomas et Archer ont montré que des localisations chromosomiques uniques de Tn, un transposon de résistance de S epidermidis codant pour l’AAC’APH bifonctionnel, engendrent des bandes de tailles différentes dans l’analyse de la macrorestriction du génome. Les résultats de notre expérience in vivo hypothèse d’évolution spontanée de l’un à l’autre motif de bandes Nous avons trouvé l’évolution de la R t De plus, nous avons remarqué l’émergence de souches qui étaient passées de la résistance à l’érythromycine / clindamycine à la susceptibilité sans modifications génétiques détectables. Galdbart et al ont rapporté la perte de mecA dans S epidermidis au cours de la sous-culture in vitro sans modification détectable de la macrorestriction de SmaI. modèle, malgré le fait que mecA est localisé chromosomiquement Enfin, nous avons également détecté un troisième motif de bandes sans changements phénotypiques détectables, comparable à l’évolution de R vers R ou S vers S. Ensemble, ces nouveaux clones sont des preuves évidentes de variabilité génétique Au cours d’une seule période infectieuseL’analyse génétique des souches de l’épisode précédent d’endocardite en décembre dans notre p atient n’a pas montré de clones multiples Cela suggère que la variabilité génétique pourrait être une caractéristique spécifique à la souche, dépendante, par exemple, de la présence de transposons particuliers. D’autre part, in vivo, les infections associées au corps étranger pourraient fournir un environnement plus favorable. D’après nos résultats, on peut déduire que des modifications génétiques peuvent survenir au cours d’un événement infectieux et entraîner des différences de susceptibilité aux antibiotiques, ce qui renforce les conclusions d’autres chercheurs selon lesquelles l’antibiothérapie basée sur les tests de sensibilité Ceci souligne également la nécessité de plus d’études pour déterminer l’incidence précise des infections polyclonales soit par la co-infection ou la variabilité génétique de la bactériémie associée à un corps étranger causée par la présence d’une coagulase négative. Staphyloco à coagulase négative cci

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