Excrétion prolongée de quasi-espèces de virus de l’influenza A résistantes à l’amantadine après l’arrêt de la thérapie antivirale chez un patient immunodéprimé

Des études phénotypiques et moléculaires ont été menées pour caractériser plusieurs isolats d’influenza A prélevés chez un patient immunodéprimé décédé d’une pneumonie virale et fongique. La récupération d’isolats résistants à l’amantadine a été corrélée à la détection de codons M variants résistants aux médicaments et associée à un virus de type Les virus mutants ont persisté dans la population virale en proportions variables μ mois après l’arrêt du traitement antiviral Ces résultats confirment les études animales rapportées ailleurs concernant la stabilité génétique des mutants de la grippe M et leur potentiel de transmission chez l’homme

e domaine de la protéine M Nous décrivons un cas de pneumonite virale mortelle chez un patient immunodéprimé qui a excrété des virus grippaux A résistants à l’amantadine μ mois après l’arrêt de la thérapie antivirale.Cas Un homme âgé de leucémie lymphoïde chronique a été admis Son traitement de chimiothérapie comprenait du cyclophosphamide, de la doxorubicine, de la vincristine et de la prednisone. L’analyse des radiographies pulmonaires a révélé la présence d’une pneumonie interstitielle diffuse. Un ponction nasopharyngée a été récupéré à l’admission. La bronchoscopie effectuée quelques jours plus tard a révélé la présence de kystes de Pneumocystis carinii, bien que le lavage alvéolaire ait été négatif pour les bactéries et les virus. Le patient a été traité avec une cure de triméthoprime-sulfaméthoxazole pendant un mois et avec de la ribavirine nébulisée pendant plusieurs jours. amélioration initiale, le patient présent a été diagnostiqué positif au virus de la grippe A par un test d’immunofluorescence en février, ce qui a été confirmé par un résultat positif de la culture d’un échantillon d’expectoration. Après une amélioration clinique, le patient a été libéré en mars, mais il a été réadmis en mars pour une dyspnée accrue et une toux productive. Une deuxième bronchoscopie a été réalisée en mars et l’échantillon obtenu était positif pour la grippe. A par immunofluorescence Le patient a été traité avec une deuxième dose d’amantadine mg en mars et il a été sorti en mars avec une amélioration des symptômes respiratoires et des résultats sur les radiographies thoraciques. En avril, le patient a été réhospitalisé pour fièvre, toux persistante. , hypoxémie et infiltrats pulmonaires qui se détériorent Cultures de sputu m échantillons prélevés à l’admission étaient tous les deux positifs pour les échantillons de grippe A et, adénovirus, et Aspergillus fumigatus Une troisième bronchoscopie effectuée en avril a révélé des cultures positives pour l’échantillon de grippe A, les sécrétions bronchiques; échantillon, lavage alvéolaire, adénovirus, et A fumigatus Une biopsie ouverte du poumon gauche a été réalisée quelques jours plus tard en raison de la détérioration du patient, et les résultats de l’analyse histopathologique étaient compatibles avec une pneumonie virale et fongique. A partir du mois d’avril, le patient a été traité par trovafloxacine, amantadine, amphotéricine B et ribavirine nébulisée par des γ-globulines. Le patient a subi une intubation en avril et est décédé en mai. Les isolats grippaux ont été récupérés par culture sur des cellules rénales canines Madin-Darby à partir d’expectorations ou d’échantillons de lavage broncho-alvéolaire. Le typage viral et le sous-typage ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux BioWhittaker et RT-PCR pour le gène hémagglutinine. La sensibilité à l’amantadine, rapportée comme le IC de concentration inhibitrice de%, a été évaluée par ap La résistance à l’amantadine a été définie comme une CI de ≥ μg / mL Les mutations du gène AM de la grippe ont été évaluées de diverses manières. , l’analyse de séquence de la région M amplifiée par RT-PCR du segment d’ARN a été réalisée comme décrit ailleurs En outre, chaque produit amplifié a été digéré avec -U des enzymes de restriction SspI, ItaI, MwoI et AciI pour rechercher la présence de séquences de type sauvage ou mutantes aux codons,, et, respectivement, Les produits digérés ont été analysés sur un gel d’agarose% coloré au bromure d’éthidium. Le rapport de différents variants a été estimé en mesurant l’intensité de bandes spécifiques sur gel avec Alpha Alpha. InnotechResults Cinq virus de la grippe A HN récupérés à partir d’expectorations ou d’échantillons de lavage broncho-alvéolaire étaient disponibles pour le tableau des analyses phénotypiques et génotypiques Le premier virus, qui a été retrouvé le quatrième jour du traitement par l’amantadine, était sensible au médicament, avec une CI de μg / mL. Les nombres de virus subséquents – qui ont été récupérés – quelques jours après l’arrêt du traitement d’une journée par l’amantadine, avaient des valeurs de IC supérieures à la valeur de la première gamme de CI isolées, – μg / mL L’analyse de séquence du produit amplifié par RT-PCR a révélé une mutation au niveau du codon Ser → Asn dans les virus des échantillons – et une seconde mutation au niveau du codon Val → Ala dans les virus récupérés des échantillons – Analyse enzymatique de restriction des produits amplifiés ont montré des mélanges variables de virus mutants et de type sauvage aux codons et dans le dernier tableau d’échantillons; figure La parenté génétique entre les isolats a été confirmée grâce à des séquences identiques pour les données de région hémagglutinine hypervariable non montrées

Tableau View largeTélécharger les analyses phénotypiques et moléculaires des isolats de virus grippaux A récupérés chez un patient immunodépriméTable View largeTélécharger diapositiveAnalyses phénotypiques et moléculaires des isolats de virus grippaux A récupérés chez un patient immunodéprimé

Figure Vue largeDownload slideRPC analyse de restriction du gène M dans plusieurs échantillons d’isolats de grippe A -; Tableau récupéré à partir d’un patient immunodéprimé Les produits de PCR ont été digérés avec l’enzyme SspI gauche et MwoI juste pour déterminer la présence de mutations aux codons et, respectivement Sample est un virus de type sauvage pour les deux codons, et échantillons – contiennent des proportions variables de mutations à – codonsFigure View largeTélécharger une analyse de restriction de la PCR du gène M dans plusieurs échantillons d’isolats de grippe A -; Tableau récupéré à partir d’un patient immunodéprimé Les produits de PCR ont été digérés avec l’enzyme SspI gauche et MwoI juste pour déterminer la présence de mutations aux codons et, respectivement Sample est un virus de type sauvage pour les deux codons, et échantillons – contiennent des proportions variables de mutations à Le cas que nous présentons est exceptionnel à bien des égards Tout d’abord, le patient que nous décrivons, qui souffrait de leucémie lymphoïde chronique, a développé une pneumonie due à de multiples virus grippaux A, RSV et adénovirus et fongiques Pneumocystis carinii et Aspergillus fumigatus pathogènes. déterminer l’impact de chaque agent pathogène sur la progression du patient vers l’insuffisance respiratoire, le rôle du virus de la grippe A est sans équivoque, confirmé par sa présence dans les derniers échantillons de lavage broncho-alvéolaire et par l’examen d’un échantillon de biopsie pulmonaire gaucheSecond, notre cas illustre l’hétérogénéité extraordinaire des populations de virus de la grippe A qui peut coexister chez des patients immunodéprimés Quelques cas de sujets immunodéprimés infectés par des mutations du gène M double ont été décrits ailleurs Notre étude élargit ces résultats précédents en montrant la présence simultanée de mutants aux codons et, chacun mélangé à un virus sauvage dans De nombreux isolats récupérés de notre patient patient, des virus provenant d’échantillons et récupérés le même jour à partir de sécrétions bronchiques et de prélèvements alvéolaires, contenaient différentes populations virales: un double codon et un seul codon mutant, respectivement tableau Comme rapporté ailleurs , les mutations au codon de la protéine M sont les mutations les plus fréquemment rapportées dans les isolats résistants à l’amantadine et à la rimantadine. Cependant, des données insuffisantes existent sur l’impact des différentes mutations sur le phénotype du médicament et sur la pathogénicité ou la transmissibilité. mutants Notre étude montre que la mutation au codon Ser → Asn était associée à un phénot résistant isolat de ype; tableau et que la combinaison des codons mutants et mélangé avec des isolats viraux de type sauvage – a abouti à des valeurs IC encore plus élevées, qui étaient ~ plus élevées que la CI de l’isolat de type sauvage récupéré au début de la thérapieThe conclusion la plus intéressante de notre étude est liée à l’excrétion prolongée des virus mutants de la grippe A après l’arrêt du traitement par l’amantadine Bien que l’élimination continue des virus résistants après suppression de la pression antivirale ait été rapportée ailleurs, la persistance de ces mutants viraux μ mois après la fin de À notre connaissance, la thérapie chez notre patient est la plus longue. De tels résultats in vivo confirment les résultats d’études chez l’animal qui ont démontré la stabilité génétique de certains virus résistants à l’amantadine. Il a été démontré que les virus résistants virus de type dans certains modèles expérimentaux animaux avec un potentiel pathogène similaire Cependant, on ne sait pas pour combien de temps ces mutants peuvent être perpe tuated dans la nature en l’absence de médicaments Une étude récente a rapporté la circulation de mutants viraux pharmacorésistants principalement SerAsn en l’absence de médicaments, bien que c’était un événement rare Outre le fait que la présence de virus résistants à l’amantadine peut avoir contribué à la mort de nos patients, l’excrétion prolongée de ces virus a également des implications importantes sur la santé publique, car certaines études ont montré qu’ils pouvaient être transmis efficacement Des études futures sont nécessaires pour évaluer l’efficacité des nouveaux inhibiteurs de la neuraminidase. infections grippales chez les patients immunodéprimés

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