Répartition par âge de la réactivité des cellules T au virus de la vaccine dans une population en bonne santé

Le potentiel de bioterrorisme impliquant la variole a conduit à un débat sur la durabilité de l’immunité protectrice contre la variole de la vaccination. En évaluant la réactivité des cellules T au virus de la vaccine dans une population saine, nous montrons que les sujets ont été vaccinés au cours des dernières décennies. cicatrice de vaccination visible avait une réactivité cellulaire T remarquable Cependant, la personne qui a été vaccinée au cours des dernières décennies, mais qui n’ont pas de cicatrice et ceux qui ont été vaccinés & gt; il y a des décennies, les réponses étaient aussi faibles que chez les sujets non vaccinés. Ainsi, nous estimons que la réponse significative de la mémoire des lymphocytes T au virus de la vaccine après une vaccination réussie peut persister pendant seulement quelques années. des fréquences de l’expression des CD spécifiques à la vaccine sur des sous-ensembles de cellules T Ces données peuvent aider à élaborer des stratégies de santé publique pour contrer les menaces bioterroristes associées à la variole

La variole a été déclarée éradiquée, et la vaccination de routine avec le virus de la vaccine a été arrêtée & gt; il y a des années dans la plupart des pays Le potentiel d’une attaque bioterroriste par la variole a conduit à un débat sur la durabilité de l’immunité protectrice contre la variole de la vaccination L’immunité acquise par la vaccination est rapidement déclinée par certains experts. La controverse a suscité des inquiétudes au sein de l’establishment politique quant à qui devrait recevoir les vaccins en premier si une épidémie survient lorsque les fournitures sont limitées À Taiwan, la vaccination systématique et obligatoire à l’échelle nationale avec la souche Lister a été menée pour & gt; Comme les vaccins antivarioliques n’étaient plus fabriqués après, l’offre de vaccins antivarioliques serait sévèrement limitée à Taïwan si une épidémie devait se produire et si une vaccination de masse était nécessaire en vue d’éventuelles attaques bioterroristes par la variole, nous devons Pour savoir comment protéger la population actuelle Pour aborder ce problème, nous avons mené une étude transversale pour déterminer les réponses immunologiques au virus de la vaccine dans notre population actuelle. Les cellules T ont été reconnues comme jouant un rôle central dans le succès de la variole. Nous avons évalué les réponses des lymphocytes T CD spécifiques de la vaccine en utilisant des tests de prolifération des lymphocytes et des réponses des lymphocytes T CD en mesurant l’activité des LTC des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du virus de la vaccine. nous avons essayé de développer un test rapide et facile à utiliser pour évaluer quantitativement le vaccin Immunité cellulaire spécifique à l’ia dans cette étude

Sujets et méthodes

la réponse des cellules T CD spécifiques à l’accinia a été évaluée en utilisant des tests de prolifération des lymphocytes en déterminant les fréquences des cellules T CD avec l’incorporation de bromodésoxyuridine BrdU après stimulation par le kit de flux BrdU du virus de la vaccine; BD PharMingen, comme décrit par ailleurs PBMC ont été préparés à partir d’échantillons de sang total et ont été isolés par centrifugation différentielle sur FICOLL-PAQUE Pharmacia Biotech PBMC par puits dans une plaque à fond rond bien ont été incubés pendant des jours à ° C avec μL de vaccine pfu / cellule virale, préparé sous forme de pfu en μL de liquide de reconstitution; Lister souche [aimablement fourni par le Center for Disease Control, Taipei, République de Chine] ou μL de liquide de reconstitution mol / L d’acide citrique, mol / L de phosphate de sodium, et% de glycérol, seul ou avec mitogène, dans un volume final de μL de milieu RPMI complet Phorbol myristate acétate PMA; ng / mL; Sigma et ionophore de calcium ng / mL; Les cellules avec incorporation de BrdU ont été détectées par cytométrie en flux. Les PBMC ont été colorées avec des anticorps monoclonaux conjugués à la fluorescéine sur CD CyChrome puis fixées avec du paraformaldehyde, perméabilisées avec de la saponine, et colorées avec anti-BrdU-FITC, conformément au protocole de coloration BrdU Flow Kit du fabricant. Un total de, les événements ont été analysés pour chaque échantillon La réponse lymphoproliférative spécifique de la vaccine des cellules T CD a été calculée comme suit: [la fréquence de CD Mesure de la réactivité des cellules CDT spécifiques à la vaccine Les cellules T CD ont été isolées séparément des PBMC en utilisant des méthodes immunomagnétiques CD Positive Isolement; Dynal AS selon les recommandations du fabricant Après analyse par cytométrie en flux, la pureté des cellules T CD était>% cellules T CD isolées par puits ont été préparées comme cellules effectrices par incubation avec des monocytes autologues en tant que cellules présentatrices d’antigène; rapport,: avec le virus de la vaccine pfu / monocyte, dans un volume final de ml de milieu RPMI complet dans des plaques -well pendant des jours Dans notre observation, un ratio de cellules présentatrices d’antigène APCs: Cellules T CD Si le rapport des APC aux lymphocytes T était inférieur à:,,, ou:, l’activité CTL induite peut être variable ou indétectable Les monocytes autologues ont été préparés comme cellules cibles monocytes / mL en étant pulsés avec le virus de la vaccine pfu / Cellule ou avec μL de liquide reconstituant seul dans -plans mL / puits pour h d’incubation Dans cette étude, un kit de dosage de cytotoxicité à libération de lactate déshydrogénase non radioactive LDH CytoTox Cytotoxicity Non-Radioactive Assay; Promega a été utilisé, avec un rapport effecteur / cible:, conformément aux instructions du fabricant Un rapport E / T de: a les données les plus interprétables pour le test de cytotoxicité libérant la LDH Rapports E / T de: ou: peut conduire à une LDH confuse -releasing data car il y a un plus petit nombre de cellules cibles Le pourcentage de cytolyse spécifique de la vaccine a été calculé comme suit: [pourcentage de cytolyse des monocytes pulsés par le virus de la vaccine] – [pourcentage de cytolyse des monocytes pulsés par le fluide reconstituant seul] Fréquences de la vaccine Gibco supplémenté avec de la pénicilline-streptomycine et du sérum de veau fœtal Gibco sur des plaques -well mL / puits PBMCs ont été incubés avec des μL de virus de la vaccine pfu / cellule, préparés en pfu en μL de fluide reconstituant ou μL de fluide reconstituant seul, dans un volume final de mL de milieu RPMI complet Après h d’incubation à ° C, les PBMC ont été colorées les anticorps monoclonaux conjugués à la fluorescéine à CD CyChrome, CD PE et CD FITC; PharMingen et ont ensuite été analysés par cytométrie en flux Becton Dickinson CD peut être le premier marqueur d’activation pour les lymphocytes humains Cependant, contrairement à la stimulation mitogène, h d’incubation est nécessaire pour une stimulation antigénique pour atteindre une expression stable et CD Incubation de un antigène pour & lt; h peut conduire à des résultats incohérents Les PBMC ont été déclenchées dans la population lymphocytaire par diffusion directe et latérale et ont été déclenchées séquentiellement dans des cellules CD ou CD; ils ont ensuite été analysés pour déterminer les fréquences d’expression de CD. Au total, des événements ont été analysés pour chaque échantillon. Les fréquences d’expression de CD spécifiques à la vaccine ont été calculées comme suit: [la fréquence d’expression de CD lorsqu’incubée avec le virus de Analyse statistique L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel statistique SPSS, version SPSS. Pour l’analyse des données continues, le test non paramétrique de Mann-Whitney U a été utilisé. La corrélation linéaire a été évaluée par le coefficient de corrélation de Pearson. -tailed, et un niveau de signification a été utilisé

Résultats

La distribution de la réactivité des cellules T contre le virus de la vaccine dans chaque groupe d’âge révèle certains points importants. Figure 1: les réponses des lymphocytes T CD et CD spécifiques à la vaccine diminuent évidemment avec l’âge; Seuls les sujets du groupe B porteurs d’une cicatrice vaccinale présentaient des réponses lymphocytaires T remarquables au virus de la vaccine. Deuxièmement, dans les deux groupes B et C, les réponses lymphocytaires T chez les sujets ayant une cicatrice vaccinale étaient significativement plus élevées que chez les sujets sans cicatrice. Réponses des lymphocytes T CD dans les groupes B et C, P = × – et × -, respectivement; pour les réponses des cellules T CD dans les groupes B et C, P = × – et × – respectivement. Cependant, dans le groupe D et le groupe E, les réponses des lymphocytes T chez les sujets avec une cicatrice vaccinale sont similaires à celles des sujets sans cicatrice. Troisièmement, les sujets du groupe A, qui n’ont jamais été vaccinés avec le virus de la vaccine et qui sont nés après l’éradication de la variole, présentent des réponses lymphocytaires T spécifiques à la vaccine, faibles mais détectables, similaires à celles des sujets sans cicatrice. groupe d’âge P non représenté Les données sur la réactivité des cellules T sous stimulation mitogène ont montré que les résultats dans tous les groupes d’âge étaient des données similaires non montrées et que la réactivité des lymphocytes T ne diminuait pas avec l’âge

Figure Vue grandDownloadCDCD top et CD bottom Réactivité des cellules T au virus de la vaccine chez les sujets avec ou sans cicatrice vaccinale dans chaque groupe d’âge Barres noires, résultats pour les sujets vaccinés avec une cicatrice vaccinale; barres grises, sujets vaccinés sans cicatrice de vaccination; barres blanches, sujets non vaccinés Les données sont présentées en médiane SD BrdU, bromodésoxyuridineFigure View largeTélécharger slideCD et CD bottom Réactivité des cellules T au virus de la vaccine chez des sujets avec ou sans cicatrice vaccinale dans chaque groupe d’âge Barres noires, résultats pour sujets vaccinés avec cicatrice vaccinale ; barres grises, sujets vaccinés sans cicatrice de vaccination; barres blanches, sujets non vaccinés Les données sont présentées en médiane SD BrdU, bromodésoxyuridine Expression CD spécifique à la vaccine sur sous-ensembles de lymphocytes T Pour savoir si la réactivité des lymphocytes T spécifique à la vaccine pourrait être facilement évaluée par les fréquences d’expression CD spécifiques Nous avons comparé les fréquences de l’expression CD spécifique de la vaccine sur les cellules T CD avec l’activité lymphoproliférative spécifique des cellules T CD CDV, et les fréquences de l’expression CD spécifique à la vaccine sur les cellules T CD avec l’activité CDL CD spécifique à la sujets Nous avons trouvé que les fréquences de l’expression CD spécifique à la vaccine sur les lymphocytes T CD pouvaient être bien corrélées avec les réponses lymphoprolifératives CD spécifiques à la vaccine, haut, et la relation entre les fréquences de l’expression CD spécifique à la vaccine sur CD T et la vaccine -activité CDL CD spécifique était également significative figure, bas

Figure Vue largeDownload slideCorrelation entre les fréquences d’expression CD spécifique de la vaccine sur les sous-ensembles CD et CD et les résultats d’essais standard pour la détermination de la réactivité des lymphocytes T spécifique du virus de la vaccine. et analyse de l’activité cytolytique a été utilisée pour les lymphocytes T CD, régression linéaire CTL, lymphocyte T cytotoxiqueFigure View largeDownload slideCorrélation entre les fréquences de l’expression CD spécifique à la vaccine sur les sous-ensembles et les résultats des tests standard pour la détermination de spécifiques à la vaccine. Réactivité lymphocytaire Le test de prolifération lymphocytaire avec incorporation de bromodésoxyuridine BrdU a été utilisé pour les cellules T CD, et le test d’activité cytolytique a été utilisé pour les lignées de cellules T CD, régression linéaire CTL, lymphocyte T cytotoxique

Discussion

Demkowicz et ses collaborateurs ont montré que l’immunité des lymphocytes T spécifiques de la vaccine peut persister jusqu’à plusieurs années après l’immunisation contre la variole dans l’enfance en l’absence présumée d’exposition au virus de la vaccine. Dans certains cas, l’absence de cicatrice vaccinale peut indiquer qu’ils n’ont jamais été effectivement vaccinés ou que leurs vaccinations n’ont pas été couronnées de succès. Cependant, même si les vaccinations sont envisagées Si la vaccination contre la variole a été administrée il y a plus de dix ans, elle peut ne pas fournir de protection actuelle. Des tests actuellement disponibles pour évaluer la réactivité spécifique des cellules T, tels que le test de prolifération, le test de cytotoxicité, ou immunospot , prennent du temps, et certains d’entre eux impliquent la manipulation de tapis radioactifs Dans cette étude, nous avons développé un test rapide et facile à utiliser pour évaluer quantitativement l’immunité cellulaire spécifique à la vaccine CD, un membre de la superfamille des lectines des récepteurs transmembranaires transmettant le signal, est le marqueur de surface d’activation le plus précoce. lymphocytes humains La détermination de la fréquence d’expression de CD sur des sous-ensembles de lymphocytes T après stimulation par cytométrie de flux ne nécessite que h d’incubation et de manipulation, et a été utilisée pour évaluer l’immunité cellulaire contre la tuberculose et le cytomégalovirus Les cellules exprimant CD après incubation avec un antigène ne sont pas nécessairement des cellules spécifiques d’antigènes, nous montrons ici que les fréquences d’expression de CD sur les cellules T après la stimulation du virus de la vaccine représentent l’étendue de l’activation spécifique de la vaccine. les fréquences de l’expression de la CD spécifique à la vaccine sur des sous-ensembles de lymphocytes T peuvent être un simple marqueur de substitution pour mesurer la réponse des lymphocytes T spécifiques de la vaccine Le meilleur moyen de déterminer la durabilité de la mémoire immunologique du virus de la vaccine à partir de la vaccination antivariolique est de mener une étude longitudinale avec un suivi pendant des décennies. impossible de s’appuyer sur ce genre d’étude longue quand il y a la possibilité que le bioterrorisme puisse se produire à n’importe quel moment De plus, il est difficile de déterminer combien de réactivité des cellules T au virus de la vaccine est suffisante pour protéger contre la variole ou réduire la sévérité de la maladie Parce que la revaccination ne provoque pas de cicatrice et que la revaccination n’est pas clairement enregistrée dans les documents gouvernementaux, il est difficile d’évaluer l’impact de la revaccination sur la durabilité de la réactivité des lymphocytes T Malgré les limites énumérées ci-dessus, ces données impliquent monde peut être plus sensible à la variole que ce qui était attendu auparavant [,,] et qu’il y a un lac k de l’immunité collective, parce que la plupart des pays ont cessé de fournir la vaccination contre la variole & gt; Il y a des années Ces données peuvent aider à établir des stratégies de santé publique et des modèles de politiques pour contrer la menace de la variole associée au bioterrorisme

Remerciements

Nous remercions le Center for Disease Control de la République de Chine d’avoir fourni la souche Lister du virus de la vaccine et de l’avoir aidé à mener à bien cette étude

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