Utilisation de techniques moléculaires pour distinguer entre l’échec du traitement et la réinfection exogène par Mycobacterium tuberculosis

Nous avons étudié les moyens par lesquels la pharmacorésistance apparaît chez les souches de Mycobacterium tuberculosis sensibles aux médicaments pendant le traitement antituberculeux. Patients ayant connu un échec du traitement de la tuberculose pulmonaire active, ayant initialement reçu un diagnostic d’infection tuberculeuse M sensible aux médicaments et ayant au moins Onze patients ayant reçu des isolats séquentiels de M tuberculosis ont été recrutés dans l’étude. Les données cliniques et les tableaux de traitement ont été analysés et corrélés avec les profils de sensibilité aux médicaments. Profils RFLP de polymorphisme de longueur de fragment de restriction Six patients ont excrété des souches de tuberculose M sensibles au médicament isogénique, alors que chez les autres patients, la souche isolée est passée d’un phénotype sensible à un phénotype résistant. motif, qui montrent Réinfection avec une nouvelle souche La réinfection exogène par la tuberculose M résistante aux médicaments peut être interprétée comme une émergence de résistance aux médicaments si les techniques d’analyse moléculaire ne sont pas utilisées.

Mycobacterium tuberculosis est un agent pathogène efficace chez l’homme qui a infecté environ un tiers de la population mondiale. Malgré l’efficacité de la chimiothérapie antimicrobienne, la tuberculose reste la principale cause de mortalité infectieuse dans le monde D’autre part, l’émergence de la résistance aux médicaments antituberculeux a été considérée comme un autre mécanisme important par lequel M tuberculosis s’adapte aux conditions de l’hôte lorsque le virus de l’immunodéficience hôte reçoit un traitement antimicrobien M souches de tuberculose résistantes aux médicaments antituberculeux ont été trouvés dans tous les sites géographiques étudiés par l’Organisation mondiale de la Santé OMS entre et La prévalence médiane de la multirésistance aux nouveaux cas de tuberculose était de%, mais la prévalence en Estonie, un des anciennes républiques soviétiques, était beaucoup plus élevé% L’utilisation très irrégulière de trea anti-TB En Estonie, ce qui ne correspond pas à la stratégie globale de traitement de l’OMS, a été associé à des taux élevés de tuberculose multirésistante aux antibiotiques MDR M, c’est-à-dire résistante au moins à l’isoniazide et à la rifampicine . A notre connaissance, la chimiothérapie en cas d’échec de la tuberculose n’a pas encore été prouvée par des études directes évaluant l’émergence d’une pharmacorésistance lors d’une infection par la tuberculose M sensible aux médicaments. Les méthodes moléculaires d’essai pourraient fournir de bons outils pour déterminer si La TB est causée par des souches génotypiquement isogéniques. La méthode moléculaire bien standardisée et la plus largement appliquée pour l’étude des isolats du complexe M tuberculosis est le typage RFLP de polymorphisme de longueur de fragment de restriction De même, pour distinguer les souches de M tuberculosis, le spoligotypage a été appliqué avec succès en plus du typage RFLP de l’IS Indépendamment des techniques moléculaires et des marqueurs génétiques disponibles, peu de chercheurs se sont concentrés spécifiquement sur l’utilisation simultanée de méthodes d’investigation bactériologiques, moléculaires / génétiques et cliniques pour étudier la relation entre la qualité du traitement et le développement de la résistance. Examiner les moyens par lesquels la pharmacorésistance évolue souches tuberculeuses M sensibles pendant le traitement antituberculeux, une série de cas rétrospectifs comprenant des patients tuberculeux ayant connu un échec de traitement de la TB pulmonaire active et ayant initialement reçu un diagnostic d’infection à tuberculose M sensible aux médicaments ont été sélectionnés au Laboratoire national estonien de référence. Archive ENRL pour notre étude Le test RFLP et le spoligotypage IS ont été utilisés, et les résultats ont été corrélés avec les résultats des tests de sensibilité aux médicaments et le régime de traitement et les données sociodémographiques

Patients, matériaux et méthodes

Patients De janvier à décembre, des patients de Tartu, en Estonie, atteints de tuberculose pulmonaire confirmée par culture ont été identifiés par l’ENRL. Au cours de la période, des isolats séquentiels de patients ont été testés pour leur sensibilité aux médicaments. patients: diagnostic initial d’infection pulmonaire avec tuberculose M sensible aux médicaments, test d’isolats au moins séquentiels pour la sensibilité aux médicaments et intervalle de ⩾ mois entre le premier et le deuxième ou le deuxième et le troisième isolats. Trente et un patients ont été testés au moins des isolats en série pour la sensibilité aux médicaments Pour ces patients, l’intervalle entre les tests du premier et du second ou du deuxième et du troisième isolat était de ⩾ mois; le premier isolat provenant des patients était sensible au médicament testé. Le premier isolat de ces patients n’était pas disponible pour des tests moléculaires supplémentaires et pour le patient, les isolats séquentiels n’étaient pas génotypés. Par conséquent,% des patients et M isolats tuberculeux étaient inclus table d’analyse, chiffre

Table

Voir grand

Télécharger le diaporama

Voir grand

Télécharger le diaporama

Profils de sensibilité aux médicaments des isolats de Mycobacterium tuberculosis provenant d’échantillons d’expectorations séquentiels provenant de patients atteints de tuberculose

Table

Voir grand

Télécharger le diaporama

Voir grand

Télécharger le diaporama

Profils de sensibilité aux médicaments des isolats de Mycobacterium tuberculosis provenant d’échantillons d’expectorations séquentiels provenant de patients atteints de tuberculose

Figure Vue largeTélécharger diapositive Intervalles entre les isolements séquentiels obtenus à partir de patients atteints de tuberculose dans les groupes et Diamonds, isolats sensibles à la drogue de Mycobacterium tuberculosis; cercles, des isolats multirésistants de tuberculose M avec le génotype de BeijingFigure Voir en grandDiaporama de téléchargement Intervalles de temps entre les isolats séquentiels obtenus de patients atteints de tuberculose dans les groupes et Diamonds, isolats sensibles à la drogue de Mycobacterium tuberculosis; cercles, isolats multirésistants de tuberculose M avec le génotype de Pékin Données cliniques La stratégie de lutte antituberculeuse recommandée par l’OMS, qui inclut le traitement sous observation directe et la chimiothérapie de courte durée, a été appliquée uniquement en Estonie pour documenter la régularité. Nous avons cherché dans les fiches de traitement des patients et les fiches de consultations externes les données cliniques suivantes: durée de l’épisode TB actuel, durée de chaque traitement et durée totale du traitement, les conditions dans lesquelles le traitement a été administré: hôpital, milieu ambulatoire, observation directe, nombre et durée des interruptions de traitement, et les médicaments inclus dans chaque régime. De plus, certains résultats sociodémographiques défavorables – chômage, abus d’alcool, et l’emprisonnement avant-ont été utilisés pour les analysesM tuberculosis Tous les échantillons disponibles que nous avons analysés ont été conservés congelés à-° C avant des tests supplémentaires. Les isolats cliniques ont été identifiés comme M tuberculosis par l’utilisation d’une sonde ADN ACCUProbe; GenProbe Isolates ont été testés pour la sensibilité au point de rupture de la rifampicine, μg / mL, point de cassure de l’isoniazide, μg / mL, point de cassure de la streptomycine, μg / mL et point de rupture de l’éthambutol, μg / mL par la méthode radiométrique de Bactec. de la variation de l’indice de croissance du contrôle avec celle des médicaments d’essai, comme recommandé par le fabricant Techniques moléculaires IS RFLP et spoligotypage ont été utilisés pour évaluer la stabilité des isolats en série Pour IS RFLP, M isolats de tuberculose ont été repiqués sur Löwenstein -Jensen pentes à ° C pendant un minimum de semaines avant l’extraction de l’ADN ADN chromosomique a été préparé par extraction d’ADN chloroforme-alcool isoamylique, et μg d’ADN de chaque isolat a été restreint avec PvuII Séparation d’ADN restreint PvuII par électrophorèse, hybridation Southern blot avec une sonde PCR -bp qui a reconnu le côté droit de l’IS restreint, et la détection par chimiluminescence a été réalisée à la méthode standard recommandée pour l’empreinte ADN de M tuberculosis Le spoligotypage est utilisé pour détecter les séquences d’espaceurs connues qui intercalent les séquences directement répétées dans la région de répétition directe génomique. La méthode de spoligotypage, qui est moins discriminante que la RFLP typing , a été utilisé comme un outil supplémentaire pour déterminer les relations entre les isolats en série Au total, isolats de préférence isolats de chaque patient, le premier isolat et des isolats en série ont été sélectionnés pour spoligotypage La procédure a été réalisée selon les protocoles standards ont été analysés au moyen d’un programme d’ordinateur Gelcompar, version; Mathématiques appliquées par l’utilisation du coefficient de Dice pour les calculs de similarité et la méthode de groupe de paires non pondérée avec des moyennes arithmétiques pour la classification, comme décrit ailleurs IS RFLP empreintes digitales et spoligotypage ont été faites à l’Institut suédois de contrôle des maladies infectieuses à Stockholm. réalisées à l’aide du programme SigmaStat pour Windows, les variables de la version Jandel Subject ont été examinées en utilisant le test of d’association pour les variables catégorielles et le test t pour les variables continues P & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

Données sociodémographiques et cliniques Les patients atteints de tuberculose ont pu être divisés en groupes. Le groupe comprenait des patients tuberculeux caractérisés par une excrétion continue d’isolats de M tuberculosis sensibles aux médicaments pendant μ mois, malgré un traitement antituberculeux. Le groupe comprenait des patients tuberculeux caractérisés par une excrétion continue de M Les isolats de tuberculose et un passage de la liste des souches sensibles à la liste des souches résistantes La majorité des patients dans les deux groupes étaient des hommes du groupe et du groupe L’âge moyen était la gamme d’années, – années dans le groupe et les années, La majorité des patients dans le groupe et les patients du groupe étaient alcooliques P = En outre, les patients du groupe et tous les patients du groupe étaient au chômage P = Dans les deux groupes, le patient avait déjà été emprisonné en ce qui concerne la de la tuberculose, les patients dans les groupes ne diffèrent pas P = et P =, respectivement tableau

Tableau View largeTélécharger les données sociodémographiques et cliniques pour les patients atteints de tuberculose TB qui répondaient aux critères d’inclusion de l’étudeTable AgrandirDisque de téléchargementDonnées sociodémographiques et cliniques pour les patients atteints de tuberculose TB répondant aux critères d’inclusion de l’étudeDérapants, durée du traitement et résultat pour les patients traitement quotidien initial dans les hôpitaux Pour le groupe, la durée médiane du traitement était de plusieurs jours, jours; dans le groupe, c’était la gamme de jours, – jours P =; tableau La durée de l’épisode de TB variait de à mois mois, mois pour groupe et de mois à mois, mois pour groupe P = Il n’y avait pas de différence dans la durée du traitement entre les groupes, mois et mois médians pour groupe; intervalle, – mois, et médiane, mois, pour le groupe; P = table

Table View largeTéléchargement de schémas de traitement pour les patients tuberculeux TBTable View largeTéléchargement de schémas de traitement pour les patients tuberculeux TBLes schémas thérapeutiques ont été régulièrement modifiés dans les deux groupes Traitement modifié – médian fois, changements pour les patients du groupe et – médian fois, changements pour les patients du groupe P = Dans les deux groupes, les doses quotidiennes de médicaments utilisées dans les schémas thérapeutiques étaient conformes aux recommandations de l’OMS. Le nombre d’interruptions de traitement de μ mois pendant le traitement était similaire dans les deux groupes: interruptions, et signifie, les interruptions pour les patients dans le groupe; gamme, – interruptions, et moyenne, interruptions pour les patients dans le groupe; P =; une interruption du traitement de μ mois a été considérée comme une mauvaise observance. Le résultat du traitement n’a pas différé statistiquement significativement entre le groupe et le groupe. Trois patients du groupe ont été guéris et sont décédés. Un patient du groupe a été guéri, les patients sont décédés. isolats bactériens L’intervalle entre l’obtention d’échantillons pour le premier et le dernier isolat de chaque patient variait de à jours moyens, jours pour groupe et de jours à , jours pour le groupe P = figure Vingt-six M isolats de tuberculose obtenus de patients tuberculeux étaient sensibles à la rifampicine, à l’isoniazide, à la streptomycine et à l’éthambutol, et les isolats de M tuberculosis étaient MDR, c’est-à-dire résistants à l’isoniazide et à la rifampine

Figure Vue largeTélécharger les empreintes digitales de l’ADN de l’ADN des isolats de Mycobacterium tuberculosis liés aux groupes de patients et à la maladie de Newcastle, non déterminé; RFLP, polymorphisme de la longueur des fragments de restrictionFigure View largeTélécharger les empreintes digitales de l’ADN des isolats de Mycobacterium tuberculosis liés aux groupes de patients et ND, non déterminé; RFLP, polymorphisme de longueur de fragment de restriction Dans le groupe, les patients avaient un isolat de suivi avec un modèle RFLP IS qui était identique au modèle du premier isolat Un patient avait un second isolat avec un modèle RFLP légèrement différent de celui du premier isoler la différence de bande; perte de bande, alors qu’un troisième isolat de ce patient était indiscernable du premier groupe, les patients avaient des isolats de suivi avec des modèles RFLP qui différaient clairement du modèle du premier isolat, et, dans les cas, les modèles de la première et les seconds isolats différaient de ceux du troisième. Dans tous ces cas, ces modifications ont été envisagées, après exclusion de la possibilité de contamination croisée en laboratoire, pour refléter l’apparition d’une nouvelle souche M tuberculosis. En outre, des isolats MDR M tuberculosis Les isolats ont été caractérisés par spoligotypage. Dans le groupe, les spoligotypes des isolats obtenus chez le même patient n’ont pas varié pendant la période d’étude Chez tous les patients du groupe, les spoligotypes de la le premier et le second isolats différaient Tous les isolats de MDR M tuberculosis identifiés dans le groupe avaient un spoligotype identique, celui qui appartient à la génération de Beijing. otype L’intervalle entre le moment où les isolats de M tuberculosis sensibles au médicament et le point auquel les isolats de MDR ont été récupérés dans les échantillons varie de à jours, jours, jours

Discussion

après le début du traitement chez un patient recevant un traitement ou une conversion des résultats négatifs avant l’initiation du traitement en résultats positifs d’un frottis et / ou d’une culture après le deuxième mois de traitement. Nous avons cherché à obtenir au moins des isolats séquentiels du même épisode TB de chaque patient et à maintenir un intervalle entre les isolats de ⩾ mois dans notre registre de laboratoire TB, Au cours de l’année, il y avait des patients qui remplissaient tous les critères d’inclusion, soit le diagnostic initial de TB causée par un organisme pharmacosensible, l’analyse d’isolats au moins séquentiels pour la sensibilité aux médicaments et un intervalle entre les isolats de ⩾ mois. candidats, une nette majorité proche de% a été recrutée dans notre étude. Dans la présente étude, la norme et la technique moléculaire permettant de distinguer les souches du complexe M tuberculosis, le typage RFLP IS, qui présente un haut degré de discrimination et de stabilité , a été utilisé. Le résultat le plus inattendu était qu’une réinfection exogène avec une nouvelle souche M tuberculosis au cours du même épisode tuberculeux place chez les patients En combinant RFLP avec spoligotyping, il a été possible de classer ces isolats du complexe M tuberculosis comme ayant le génotype de Beijing Bien que la propagation d’un clone de Beijing résistant aux médicaments ait été suivie dans de larges études communautaires , au mieux de nos connaissances, une association causale avec les schémas thérapeutiques cliniques et l’échec de tels régimes n’a pas été démontrée.Différentes études ont indiqué que la réinfection exogène peut se produire après un traitement réussi Cependant, des données limitées sont disponibles en ce qui concerne la surinfection. au cours du même épisode de TB Niemann et al ont décrit un patient atteint de tuberculose qui avait une double infection Avec une souche résistante aux médicaments et une souche MDR Dans notre étude, une réinfection exogène avec la famille MDR M tuberculosis de Beijing a été retrouvée chez des patients immunocompétents atteints de tuberculose pulmonaire. Dans tous ces cas, les médecins ont considéré l’émergence d’une résistance aux médicaments. résulte d’une administration non supervisée de médicaments, d’une mauvaise observance du traitement par le patient et d’erreurs dans les prescriptions médicales des schémas thérapeutiques. Des techniques moléculaires ont démontré que ce n’était pas le cas. Le traitement des patients tuberculeux infectés par des souches M de tuberculose succès Selon Mitchison et Nunn , les échecs thérapeutiques chez les patients infectés initialement par des bacilles sensibles aux médicaments sont rares chez les patients qui ont été traités par des schémas de médicaments contenant de la rifampicine. Contrairement à ces résultats, notre étude a démontré que les organismes peuvent persister comme démontré par la positivité de la culture pendant le traitement dans les expectorations pendant plusieurs mois Cependant, cette persistance a été associée à une irrégularité marquée du traitement de la TBMitchison a décrit l’émergence de la pharmacorésistance au cours d’une chimiothérapie de courte durée avec des médicaments multiples. uniquement à cause de l’irrégularité de l’administration des médicaments, du fait de l’apparition de plusieurs cycles de mort lorsque les médicaments sont pris et de la repousse lorsque la prise de médicaments s’arrête. Au cours de chacun de ces cycles, sélection de mutants résistants par rapport à la population bactérienne sensible. , est possible Cependant, les souches de M tuberculosis sensibles aux médicaments obtenues chez les patients de notre étude n’ont pas développé de résistance, malgré l’administration d’une thérapie hautement irrégulière. Ceci pourrait être le résultat d’intervalles plus longs pendant lesquels le traitement a été arrêté; par la suite, pendant la période de repousse, la proportion de bacilles sensibles pourrait rapidement augmenter à nouveau. Nos résultats montrent qu’un traitement hautement irrégulier et des facteurs sociodémographiques défavorables ne contribuent pas toujours à l’émergence de pharmacorésistances dans la tuberculose M sensible aux médicaments malgré une longue période de traitement. l’hôte n’a pas bénéficié de la sensibilité aux médicaments de l’infection par M. tuberculosis; La détection d’une surinfection par une nouvelle souche M tuberculosis lors du traitement d’un épisode de TB active n’est possible que grâce à l’utilisation d’outils d’épidémiologie moléculaire. Les résultats obtenus par l’utilisation de ces outils montrent clairement que les patients traité en milieu hospitalier peut être infecté par une souche nouvelle et plus dangereuse de M tuberculosis si les patients infectieux ne sont pas isolés; d’autre part, il se peut aussi que ces souches particulières soient extrêmement virulentes. Ce type de propagation nosocomiale de la tuberculose est obscurci par la capacité de diagnostiquer la tuberculose plus tôt dans l’évolution de la maladie et, par conséquent, l’étendue du problème reste largement inconnu

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Helle Leesik pour sa lecture critique et ses suggestions fructueuses concernant l’article

Tu peux Aussi comme